犬冠状病毒的检测与防治措施

张婷 蒋郁明 曾俊霞 侯月娥* 费奕强 薛晓阳

（1，珠海科艺普检测科技有限公司 519000；2，广东省珠海市动物疫病预防控制中心 519000；3，天津农学院水产学院 300000）

新冠疫情在全球爆发以来，对人类健康及公共卫生安全造成了严重的威胁。同时，也引起了人们对冠状病毒的高度重视。冠状病毒是一类大型的病毒家族。自然宿主范围很广可感染多种脊椎动物，如人类、犬、猫及家禽等，引发人类或动物严重的消化道、呼吸道及神经系统疾病[1]。犬冠状病毒是冠状病毒的一种，最早是由Binn 等在1971 年从腹泻的德国军犬中分离到，从此在全世界流行爆发[2]。犬冠状病毒主要引起犬急性肠胃炎。临床表现为频发呕吐、腹泻最终出现严重的脱水或酸中毒，导致犬只死亡[3]。对犬养殖业造成了严重的威胁[4]。本文主要从犬冠状病毒的病原特征、流行特点、发病机制、临床症状、诊断方法及防治措施等对犬冠状病毒进行综述。以期为犬冠状病毒引发的各种疾病的综合防治提供理论参考。

1 病原

冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属。可引起多种动物的急慢性疾病。2011 年，国际病毒分类委员会将冠状病毒分为α、β、γ 和δ 4 个属[5]。犬冠状病毒、猫冠状病毒与猪传染性肠胃炎病毒同属于α 属冠状病毒。犬冠状病毒是一类具有囊膜结构的单链RNA 病毒[6]。该病毒成圆球形或椭圆形，直径约为60～200nm，表面具有冠状病毒特有的放射形突起，均匀分布于整个病毒的表面。犬冠状病毒对热、紫外线、脂溶剂、非离子去污剂、甲醛和氧化剂等一般的化学药品均敏感，对酸稳定[7]。在-70℃状态下可保存数年；4℃可保存数月仍具有感染性[8]。

2 流行病学

犬冠状病最早是1971 年Binn 等在德国患病军犬中首次成功分离。后来被用于广泛的研究。我国初次发现犬冠状病毒是在1985 年，由徐汉坤等首次报道有犬冠状病毒的流行[9]，后来犬冠状病毒感染警犬、军犬、民用犬的事件被相继报道。犬冠状病毒的感染没有物种特异性，不同品种、年龄的犬只均可被感染。同时，对犬科的狐狸及貉也具有感染性。但相对成年犬来说，幼犬更容易被感染。2016 年孙秋艳在山东地区进行宠物犬冠状病毒病的流行病学调查中表明，一岁以内的幼犬检出率为25.2%～72.4%；2 月龄～4 月龄犬的检出率为72.4%；大于1岁犬冠状病毒的检出率低于13.4%[10]。犬冠状病毒感染具有明显的季节性。全国范围的调查显示，在春季、秋末及冬季温度较低的季节犬只发病率更高。而在夏季由于犬冠状病毒引起的疾病发生较少[11]。犬冠状病毒主要以病犬和带毒犬的粪便和污染水源为主要传染源。可以通过摄食、饮水间接或直接传染给易感犬只。感染率为100%，病死率为50%。所以要对患病犬及时进行隔离处理，并对犬舍进行全面的消毒处理。对病死犬要进行深埋处理，禁止解剖及食用。

3 发病机制

犬冠状病毒主要以病犬和带毒犬的粪便和污染水源为主要传染源。经粪口途径进入易感犬的体内，在感染后2d 到达十二指肠部分[12]。病毒表面的S 蛋白与宿主小肠内的细胞受体进行特异性结合，然后经过细胞膜的胞吞作用进入小肠绒毛间的吸收细胞内[13-14]。之后病毒利用宿主本身的复制系统帮助其自身进行复制增殖，在胞质空泡的平滑膜上出芽，造成细胞破裂[15]。犬冠状病毒被重新释放出来，加剧小肠部分的感染。最终造成小肠绒毛变粗变短，消化酶分泌停止，消化吸收能力大大降低。造成犬只腹泻[16]。如不及时对患病犬消炎补液，最终会导致机体严重脱水或酸中毒而死。一般情况下，只有犬冠状病毒感染致死力较弱。但犬冠状病毒会严重损害犬体内的NK细胞和调节性T 细胞，大大降低宿主的免疫力[17]。当与轮状病毒、犬细小病毒混合感染或遭遇气温骤变、运输、应激情况时易对犬只造成致命性的威胁。

4 临床症状

感染犬冠状病毒的犬只临床症状主要表现为精神不振、喜卧、呕吐、腹泻、血便，并伴随强烈的腹痛。多数犬只体温变化不大，感染前期呕吐物主要为未消化的食物，后期呕吐物为黄色泡沫样及黏稠的液体。随后出现严重的腹泻症状。粪便呈糊状或半糊状甚至水样，呈橙色或绿色，其中含有黏液或血液[18]。最终犬只出现脱水或酸中毒现象。临床上幼犬的发病现象比成年犬严重。病程为7～10d，部分幼犬在发病1～2d 后死亡，成年犬在服用药物一周内便可恢复，但在一个月内可能会有复发[19]。

5 诊断方法

犬冠状病毒引起的感染与轮状病毒感染出现的临床症状相似，并且常与轮状病毒、犬细小病毒混合感染，所以准确的鉴定犬冠状病毒需要做进一步的实验室检测。目前实验室检测犬冠状病毒的方法主要有病毒分离培养、电镜观察及血清学诊断技术、普通RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、纳米PCR 等。

5.1 病毒分离培养

对患病犬的粪便进行取样，在无菌条件下进行离心，取上清液于0.22um 的过滤器中进行过滤。然后将犬冠状病毒接种于犬肾脏细胞的细胞培养液中，于37℃、5% CO2条件下在恒温培养箱内培养2d[20]。接种了犬冠状病毒的细胞表现出细胞变圆、脱落没有明显的细胞轮廓的病变症状。该实验方法具有直观、简便等优点。但该实验方法与高通量筛选的方法相比灵敏度较差，耗费时间较长，人为因素较多，容易造成较大的结果误差。

5.2 电镜观察

由于犬冠状病毒具有独特的外形特征，所以可以使用电镜对其进行鉴定，观察病毒周围“冠”的有无[21]。但该实验方法的实验误差较大，使用费用昂贵等一系列缺点限制其使用，且容易出现假阴性结果。因为冠状病毒易变异，变异毒株会出现冠脱落或冠不明显等一系列特点。

5.3 血清学诊断技术

临床诊断上检测疾病较为常用的方法是血清学诊断。血清学诊断主要包括中和实验及间接ELISA 方法。熊炜等[22]通过构建重组质粒对犬冠状病毒蛋白编码基因进行克隆、表达，之后对蛋白进行纯化，建立了犬冠状病毒间接ELISA 的方法。中和实验是由Binn 等[23]首先创立的，对患病犬的血清进行采集然后进行实验鉴定。该实验方法具有极高的特异性，甚至优于ELISA 法。

5.4 普通RT-PCR

与以上实验方法相比，普通RT-PCR 具有特异性强、灵敏度高等一系列优点。普通RT-PCR 可以对轻微患病犬进行病原检测[24]。但该实验方法不能定量检测犬冠状病毒的载量。且在其实验过程中易出现假阳性及非特异性扩增等问题。

5.5 实时荧光定量RT-PCR

实时荧光定量RT-PCR 作为近年来发展起来的一种可用于病原体检测的技术，具有特异性强、敏感性高等优点，能在较短时间内完成病原体检测，被广泛应用于动物疾病检测、临床诊断等领域[25]。在犬冠状病毒特异性检测中，荧光定量RT-PCR 比普通RT-PCR 的灵敏度高10 倍。且同时具有准确率高、检测速度较快、重复性好等一系列的优点。但该实验操作需要精密的仪器及熟练的操作人员，不适用于临床上的广泛研究。

5.6 纳米PCR

纳米PCR 主要是在普通PCR 基础上，在PCR 反应体系中加入纳米金颗粒。纳米金颗粒具有较高的表面活性，可以与酶分子进行特异性结合并保持稳定。同时，由于纳米金颗粒具有较小的尺寸，可以调节聚合酶与DNA 之间的特异性结合，间接的调整聚合酶浓度，有助于引物与模板结合，提高目的基因片段的扩增效率。与此同时，纳米金颗粒良好的热传导性能有助于缩短变性时间，提高反应灵敏度[26]。在退火时，抑制非特异性片段的合成，提高PCR 的保真度。由于纳米PCR 操作简单，成本上低于荧光定量PCR，因此，纳米PCR 更适用于临床疾病的快速诊断。

6 防治措施

现在犬冠状病毒的治疗没有特效药，多采取“预防为主，加强管理的原则”。预防措施主要为每天打扫犬舍，保持犬舍清洁。对带毒母犬的产房及乳房要进行严格的消毒处理。同时，给健康犬只注射犬免疫球蛋白和犬冠状病毒高免血清，增强犬的免疫力。由于犬冠状病毒具有垂直传播的特点，所以可以对妊娠母犬注射疫苗，激发母犬体内的机体免疫，幼犬通过乳汁获得抗体，增强幼犬免疫力。

如发现患病犬，首先应对患病犬只进行及时的隔离处理。并对病犬的排泄物、犬舍及接触物进行消毒，切断病原传播途径。针对患病犬只主要采取纠正机体脱水、防止酸中毒、抑制呕吐、抗病毒为主的治疗原则。因该病主要引起犬只严重腹泻，造成犬只脱水，所以应对患病犬及时补充葡萄糖、电解质、钾离子及三磷酸腺苷纠正犬体内的酸碱及电解质失衡。同时，为了避免病犬混合感染犬细小病毒、轮状病毒可以采取干扰素、球蛋白相配合的治疗方法。犬在患病后，胃肠功能减弱或紊乱，盲目饲喂只能增加肠胃负担，导致病情进一步加重。所以，在病犬不再呕吐后可以投喂一些容易消化的食物[27]。严禁解剖和食用病死犬，应进行深埋处理。然后用生石灰、1:30漂白粉溶液、0.2%～1%甲醛溶液等有效消毒剂彻底消毒饲养场地和圈舍，避免健康犬接触病死犬污染物。

7 展望

犬冠状病毒在我国家犬、军犬及流浪犬之间普遍存在。该类病毒在复制过程中极易发生突变，治病能力也在逐渐增强。犬冠状病毒主要引起犬只呕吐、腹泻导致犬只脱水或酸中毒。但目前对该病毒的认识及重视程度远远不够。在2019 年由SARS-COV-2 引起的新冠疫情对世界各国人们的生命健康及经济发展造成了巨大的影响，也引起了人们对冠状病毒的高度重视。基因组同源性结果分析显示，SARS-COV-2 于犬冠状病毒的同源52.6%～53.0% 。虽然犬冠状病毒与SARS-COV-2较低，但也应引起人们的重视，以探索冠状病毒的起源及对不同宿主的致病性。未来还应进一步完善全国各地的犬冠状病毒流行范围，为研发更加高效的诊断技术及疫苗提供参考依据。