类风湿性关节炎间质性肺疾病动物模型概述

敖琴 李龙△ 刘俊 李俊媛 李培霆

(1.贵州医科大学附属医院风湿免疫科，贵州 贵阳 550004；2.华中科技大学同济医学院附属协和医院感染科，湖北 武汉 430022)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种病因不明的慢性自身免疫性疾病，病变主要位于四肢小关节，随着疾病发展，可累及全身各个系统，其中ILD是最常见的关节外改变。RA患者中有2%～10%可发展为类风湿性关节炎间质性肺疾病(rheumatoid arthritis- interstitial lung disease ,RA-ILD)[1]；近年来RA的总体死亡率有所下降，但ILD却成为RA患者主要死亡原因之一，并呈逐年上升趋势，占所有RA相关死亡的7-13%[2]。RA-ILD表现为肺部不同程度的炎症和纤维化活动，该过程被认为是渐进的，并在很大程度上不可逆转，其中常见的病理类型为普通间质性肺炎(usual interstitial pneumonia,UIP)和非特异间质性肺炎(non-specific interstitial pneumonia,NSIP)，而UIP在RA-ILD中最常见，表现为明显的致密纤维化和肺结构重塑[3]。目前多数观点认为，ILD是由遗传和环境因素共同造成，但具体病因和发病机制尚不清楚；临床上大多数患者在肺部出现明显症状、肺功能显著受损后才被明确诊断，这对于RA-ILD的早期识别及延缓疾病进展是一项艰巨的挑战[4]。要想进一步深入研究，选择合适的动物模型是实验进展的关键步骤。而UIP作为RA-ILD中最常见的病理类型，所以在造模过程中，通常参考UIP动物模型的造模方法。报告如下。

1 博来霉素诱导

博来霉素(bleomycin,BLM)为链霉菌中提取出来的一种细胞毒性药物，在临床上被作为抗肿瘤药物使用，因其副作用可导致肺纤维化，所以在研究类风湿性关节炎相关间质性肺疾病发病机制方面，常采用BLM诱导的肺纤维化动物模型[5]。BLM的给药方式包括气管内给药、雾化、尾静脉注射、腹腔注射等，目前常用的方法为气管内给药[6-7]。有研究比较了气管内灌注和Penncentur动物雾化器气管内雾化两种方法结果显示，Penncentur雾化器气管内雾化造成的小鼠肺纤维化病灶分布更均匀，而且可降低继发感染的风险，但与传统口鼻暴露雾化吸入相比，Penncentur气管内雾化操作复杂，费用较高[8]。而对于BLM的使用剂量，根据所选动物类型、药物使用方式的不同，在剂量上的运用也存在着显著差异，目前国内尚无确切的标准。BLM诱导的肺纤维化动物模型早期表现为间质性炎症和血管损伤，晚期以肺间质纤维化形成为特点[9]。王鹤、Mahmutovic Persson等[10-11]均使用SD大鼠作为模型，通过连续气管内灌注BLM的第3天，支气管肺泡灌洗液的总蛋白量、炎性细胞以及血浆渗出量开始增加，肺组织Masson染色显示肺间质开始出现红细胞和部分炎细胞的浸润，磁共振检查肺部也出现了肺总体积增加；而在之后的第7、21、28天炎症有所缓解，小鼠肺间隔呈中、重度增厚，肺泡结构消失，成纤维细胞及胶原基质的沉积显著。 周平[12]也采用SD大鼠器官灌注BLM，在连续给药的第7天小鼠肺组织HE染色后表现为急性炎症损害病灶，第14天后炎症有所缓解，但出现成纤维细胞的增生、肺泡结构破坏，第28天肺泡破坏严重，肺泡间隔大量胶原和纤维蛋白沉积。以上BLM诱导的病变主要集中在肺组织，其他器官暂未出现损伤表现。通过BLM诱导的间质性肺疾病，技术成熟，造模周期短，形成的间质性肺部疾病相对稳定；然而与RA-ILD的不可逆性、缓慢进展性以及形成背景的特点相比，该方法虽具有强大的可重复性和通用性，但其本身仍不能确切的复制出RA-ILD，在还原其病理变化上仍有所不足[13]。

2 胶原诱导性关节炎模型

胶原诱导关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)是目前最常用的类风湿性关节炎动物模型诱导方法，在很大程度上能复制出RA的病理状态，且造模成功率较高，但在疾病模型的诱导中，关节外的病变研究相对较少，以常见的肺间质疾病为例，只有少部分研究描述了在胶原诱导关节炎的前提下，可发生肺部炎症的变化。高波、Y.Terasaki[14-15]在利用CIA造模过程中，选择恢复期小鼠提取肺组织染色发现肺部外周血存在大量正球形、着色较深的外周血淋巴细胞以及大量红细胞，同时肺泡结构出现破坏，肺间隔增厚，毛细血管出现扩张，且TNFα、IL-6、IL-β的表达均明显上升，结果具有统计学意义。E.Schurgers等[16]利用γ干扰素受体敲除小鼠在CIA的诱导下，于免疫后的第21天小鼠肺表面发现有巨噬细胞和中性粒细胞组成白色半透明斑块，并且在血管周围和细支气管周围出现大量淋巴细胞的浸润，肺间质也含有类似于风湿结节的肉芽组织样结构浸润。之后Tomomi Sato[17]发现在首次免疫后的第7天，CIA小鼠胸膜下区开始出现炎性细胞的聚集，抗CCP抗体也在血清中被检测到；免疫后第49天肺HE染色发现肺周围，尤其胸膜下区域，炎症细胞呈片状间质浸润，其中以M2表型的CD11b巨噬细胞增多为主，该表性的巨噬细胞可促进纤维化的发生；此外还有IgG和补体C3沉积、抗瓜氨酸纤维蛋白抗体(ACPAs)产生，但之后该肺部表现逐渐减弱，免疫后第105天和161天额外免疫也未出现胶原沉积，也未显示明显的纤维化迹象，第182天肺组织的炎性改变及胶原沉积不再被观察到。通过CIA诱导的RA-ILD模型，虽然目前有关研究较少，但根据CIA小鼠肺部炎症细胞的浸润部位、补体和ACPAs滴度增高等表现来看，这种模型与人类RA-ILD明显相似。只是目前认为CIA所导致的小鼠肺改变是可逆的，没有进一步纤维化的迹象[18]。因此CIA模型造成肺部炎症变化或许可作为RA-ILD早期发病机制研究模型建立基础。

3 肿瘤坏死因子转基因诱导模型

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是RA和肺疾病持续进展的关键细胞因子[19]。Cazlaris H等[20]曾在以C57BL/6CBA为背景下，获得了肿瘤坏死因子转基因(tumor necrosis factor transgenic,TNF-TG)小鼠，该过程为通过一个包含编码整个人类TNF-α基因片段的靶向载体，其中含有ARE的3‘UTR被来自β-珠蛋白基因的3’UTR取代，植入这种靶向载体后，可增加TNF-α基因的稳定性和翻译效率，从而通过全身过表达TNG-α，导致炎性侵袭性关节炎。有学者发现在TNF-TG小鼠模型中，除有典型的关节炎病变外，还存在着ILD，并且表现为慢性、渐进性改变，与人RA-ILD更为相似[21-22]。Richard D.Bell等[23]曾利用TNF-TG小鼠诱导出ILD，并采用肺微型计算机断层扫描(MCT)小鼠肺组织，结果显示TNF-TG小鼠在所有时间点的组织体积、总肺体积和平均强度都显著增高。此外Emily K.Wu等[24]同样曾利用TNF-TG小鼠诱导ILD，与正常对照组比较后提示TNG-TG小鼠的气体交换能力受损，呼吸阻力增加，吸气量显著降低，肺顺应性、弹性也均降低。然而该实验没在病变肺组织发现胶原沉积的改变，但在肺间质组织中存在明显的炎性细胞聚集。与人RA-ILD的肺纤维化改变相比，TNF-TG模型虽不能完全描述临床疾病的所有方面，但可用来阐释TNF驱动的炎症和间质性肺疾病间的关系。

4 其 他

除上述方法外，FU Yalu等[25]在CIA模型全身免疫反应的基础上联合BLM诱导小鼠间质性肺疾病，该模型呈现出全身慢性炎症反应进行性肺纤维化持续加重的病理，与RA-ILD的临床表现更为接近。而SKG小鼠，因编码ZAP-70 SH2结构域的基因突变，可自发发生T细胞介导的慢性自身免疫性关节炎，通过腹腔注射酵母多糖的SKG小鼠可因自我耐受的破坏引起关节症状和ILD，因此亦可通过上述方法在该类型小鼠中研究自身免疫性关节炎背景下引起的ILD[26]。此外，也有利用基因工程手段来建立肺纤维化模型的研究，L.William E等[27]利用表面活性蛋白C(SFTPC)、表面活性蛋白-A2 (SFTPA2)、端粒酶逆转录酶(TERT)和端粒酶RNA(TERC)这四个基因来构建转基因小鼠，再运用四环素诱导这些基因的表达系统的启动或关闭，从而构建肺纤维化小鼠动物模型。

5 展 望

目前国内无论在研究RA-ILD还是其他原因所导致的肺间质纤维化，通常为单独复制肺部病变的模型，如BLM诱导的肺纤维化模型仍然是最常用且相对成熟的方法，但值得注意的是与人RA-ILD相比，该病变只局限在肺组织，并未引起关节受损。CIA和TNF-TG小鼠诱导的模型可兼并关节炎和间质性肺疾病两种疾病状态，这更加接近人RA-ILD的病理改变，而且更符合RA-ILD早期发病是在炎性自身免疫条件下发生的机制特点。但不足之处在于上述模型的肺部病变程度普遍较轻，且通常为可逆性改变。因此，要想获得构建相对简易且经济、全面反映人RA-ILD特征的动物模型，仍是亟需不断深入研究的内容之一。