降低替米考星杂质H的工艺研究

臧亮朋，郭佳，锁嘉伟，王祎萌(宁夏泰益欣生物科技股份有限公司，宁夏 银川 750205)

0 引言

替米考星(Tilmicosin)是英国Elanco公司于20世纪末研制成功的一种供畜禽类动物使用的大环内酯类抗生素，其分子式为C46H80N2O13，分子量为869.15[1]。主要以酒石酸泰乐菌素为原料进行半合成。抗菌活性及临床应用效果与泰乐菌素相比更优。替米考星的结构式如图1所示。

图1 替米考星结构式

替米考星的合成途径为：酒石酸泰乐菌素水解生成中间产物去碳霉糖泰乐菌素，去碳霉糖泰乐菌素与3,5-二甲基哌啶反应经甲酸还原生成替米考星[2]。化学反应式如图2所示。

图2 替米考星合成过程

在畜禽养殖过程中经常会出现一种较为常见的疾病即呼吸道疾病，在规模化养殖过程此类疾病带来的风险更高，因此，有效控制呼吸道类疾病是目前社会关注的焦点，已有诸多报道显示，呼吸道类疾病的病原菌通常为多种革兰氏阳性菌及部分阴性菌如巴氏杆菌、放线杆菌、禽大肠杆菌及支原体等，在实际病例中常常是细菌与支原体混合感染[3]。经抗菌活性验证替米考星抗菌效果优于氟苯尼考、泰乐菌素抗生素类药物等，其对大部分的革兰氏菌、螺旋体、霉形体等均有较强的抑制作用，尤其对多种螺旋体和支原体有较强的抑制作用[4]。在我国替米考星有关物质的研究较少，尤其对于单个杂质的考究关注更少，文献多为综述替米考星的合成研究进展或进行合成的工艺条件优化。孙永学等[5]介绍了替米考星在临床上的应用情况。刘德金等[6]通过改变流动相相关物质的比例优化了替米考星的HPLC检测方法；吕淑荣[7]参照国外相关专利合成了替米考星，对合成产品进行了结构确证，研究了几个关键工艺参数对收率的影响，对合成的替米考星进行了质量研究，但并未系统地研究其最佳的工艺条件。

在我国，目前市售的替米考星及其同类产品的检测根据《中国兽药典》规定，将HPLC法作为替米考星检测的标准方法，美国兽药典也收录了替米考星及其同类产品的HPLC测定方法，只是在流动相配制和样品制备方面存在差异。采用美国兽药典(USP)有关物质检测杂质H无法较稳定控制在合格质量标准内，不能满足客户要求，严重影响该标准要求的产品销售，为全球的众多企业生产带来较大困难。本文主要研究淋洗工艺对替米考星杂质H的影响，筛选淋洗工艺中最佳工艺参数，以期提高替米考星质量，降低杂质H的含量，为替米考星低杂质H成品的生产提供理论支撑。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

YP4002电子天平(上海越平科学仪器有限公司)、恒温磁力水浴锅、电磁搅拌器、岛津液相检测仪、watersC18色谱柱、酸度计。

1.2 试剂

酒石酸泰乐菌素精制液(宁夏泰益欣生物科技股份有限公司)、甲酸、3,5-二甲基哌啶、乙酸丁酯、酒石酸溶液、NaOH溶液、HCl溶液。

2 材料与方法

2.1 原料来源

本试验原料酒石酸泰乐菌素精制液由宁夏泰益欣生物科技股份有限公司提供，以下实验过程中，单份精制液试验样品体积均为200 mL。

2.2 试验方法

2.2.1 NaOH(10%)溶液配制

准确称取10 g固体NaOH置于烧杯中，加入90 g的纯化水，玻璃棒搅拌使其溶解澄清后封口膜封口备用。

2.2.2 HCl(5%)溶液配制

准确称取430.56 g纯化水置于烧杯中，称量69.44 g HCl缓慢加入烧杯中，不断用玻璃棒搅拌使其完全溶解后封口膜封口备用。

2.2.3 酒石酸(5%)溶液配制

准确称取0.5 g酒石酸锑钾置于烧杯中，加入少量纯化水溶解，再加入到100 mL容量瓶定容。

2.2.4 检测方法(USP)

用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以水-磷酸二丁胺溶液(取二正丁胺16.8 mL，加磷酸溶液70 mL，边加边搅拌，冷却后，用磷酸调节pH至2.5±0.1，加水至100 mL(975∶25)为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为280 nm，流速为1.1 mL/min。

3 结果与分析

3.1 泰乐萃取液酸洗及水洗对合成替米考星杂质H的影响

泰乐菌素系列产品众多，如泰万菌素、酒石酸泰乐菌素、盐酸泰乐菌素、替米考星等，这些都属于大环内酯类抗生素的衍生产品，其中替米考星效果明显优于泰乐系列其他产品。替米考星有关物质检测单个杂质较多，而单杂高低不仅影响产品质量也对产品销售影响较大。在替米考星所有单杂中，杂质H波动频繁，因此，如何控制或降低替米考星杂质H在质量标准范围内变得尤为重要。

本文主要以酸洗(5%酒石酸溶液)和水洗(纯化水)两种方式淋洗泰乐菌素萃取液，以未经淋洗的萃取液为对照，泰乐萃取液体积均保证在200 mL，验证其对替米考星杂质H的影响。具体结果如图3所示。

将制备完成的泰乐菌素萃取液分别进行酸洗、水洗和不做任何处理进行对照。由图3可知，采用酸洗和水洗，均对替米考星杂质H有一定影响，经酸洗后，替米考星杂质H得以有效降低，水洗组及对照组替米考星样品检测杂质H不合格(标准≤1.0%)；而酸洗后替米考星杂质H含量低于1.0%，因此，可确定对酒石酸泰乐菌素精制液制备完成的萃取液酸洗可有效降低替米考星杂质H，排除水洗，确定优化方向为酒石酸酸洗进行后续验证。

3.2 泰乐萃取液酸洗pH对合成替米考星杂质H的影响

由以上实验结果可知，酒石酸酸洗对降低替米考星杂质H效果较好，为确定酒石酸酸洗的工艺条件，首先需要确定合理pH滴加范围，用酒石酸溶液将泰乐菌素萃取液的pH调节至不同的值，考察不同pH对替米考星杂质H的影响。pH分别调节为6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0进行合成替米考星。具体实验结果如图4所示。

由图4可知，将酒石酸泰乐萃取液等量分为6份，加入酒石酸溶液进行不同pH的调节，然后合成替米考星，检测替米考星杂质H，结果如图：在pH=6.5～5.0时杂质H呈下降趋势，在pH调节至5.5～5.0时，替米考星杂质H达到合格标准(标准≤1.0%)且在pH=5时杂质H最小。继续调节pH，当PH为4.5，4时，替米考星杂质H逐渐增大且无法达到标准。因此，可确定酒石酸酸洗最佳pH为pH=5.0。

图4 泰乐萃取液酸洗pH对合成替米考星杂质H的影响

3.3 泰乐萃取液酸洗温度对合成替米考星杂质H的影响

经上述单因素实验验证结果，以酒石酸进行酸洗并将萃取液的pH调节至5.0时，替米考星的杂质H含量达到了合格标准且达到了最优值，但在此过程中，温度的变化对替米考星杂质H具有显著影响，因此，对酸洗过程中的最适温度进行筛选，具体实验结果如图5所示。

由图5可知，随着温度的提升，杂质H呈先下降后上升的趋势，当温度小于35 ℃时，杂质H均达到合格标准，且此温度下达到最低值为0.73，温度大于35 ℃杂质H均不合格，因此，可确定温度为35 ℃为最佳的酸洗温度条件。

图5 泰乐萃取液酸洗温度对合成替米考星杂质H的影响

3.4 稳定性实验

为降低替米考星杂质H，通过对泰乐萃取液淋洗液的选择、酒石酸调节pH的考察及酒石酸酸洗温度对替米考星杂质H的考察，确定酒石酸溶液为淋洗液，确定pH=5.0，确定最适宜的酸洗温度为35 ℃，进行5批稳定性实验以最终确定最佳考察条件是否稳定。具体实验结果如表1所示。

表1 稳定性实验数据表

表1 中所列数据为pH=5.0，酸洗温度为35 ℃下进行了5批稳定性实验的数据结果。由表1可知，当确定了酸洗pH及酸洗温度时，5批实验样品检测杂质H均符合(USP)有关物质单杂检测标准(标准≤1.0%)。因此，可确定酸洗最佳pH=5.0，最佳的酸洗温度条件温度为35 ℃。

4 结语

本研究以泰乐菌素精制液为实验原料，经过加入乙酸丁酯做萃取剂，加入液碱调节pH至10.0～10.5进行萃取。所得萃取液用酒石酸进行酸洗，调节其溶液的pH为5.0，同时控制酸洗温度为35 ℃，合成替米考星。

检测替米考星杂质H，替米考星杂质H均达到合格质量标准，彻底解决了替米考星合成工艺(USP)检测法中杂质H超标问题。