基于电化学适配体传感器超灵敏检测赭曲霉毒素A的研究进展

马鑫悦， 吕丽娜， 何锦涛， 李喜全， 张宝忠

(河南工业大学 环境工程学院，河南 郑州 450001)

0 前言

赭曲霉毒素A(OTA)是生长在粮食、豆类等农产品上的曲霉和青霉的代谢物，也是赭曲霉毒素中毒性最强、分布最广、对农产品危害最多的毒素。为防止其在生物体内富集，对其进行灵敏、快速的检测一直都是食品与环境等领域中值得关注的问题。

目前检测OTA常用的技术主要有酶联免疫吸附实验(ELISA)、电致发光、免疫分析技术等[1-3]。但这些传统技术往往需要昂贵的仪器、具有专业知识的操作人员、复杂的样品前处理过程且极为耗时，基于抗体的免疫分析技术还会存在一些不稳定、出现假阳性结果等问题[4]。电化学适配体传感器则因兼具快速、便捷、准确且易于操作等特点成为OTA检测技术的一个热门方向。

1 电化学适配体传感器

电化学传感器(Electrochemical sensors)是一种对特定物质敏感并可以将这种物质的浓度转化为电信号进行检测的仪器[5]。由特定物质作为识别原件，例如：酶、抗体、抗生素、重金属等，与相应的转化器所构成的分析系统。其装置主要由识别检测和传感器两个部分构成。识别检测部分起到识别靶标及其浓度的作用，而传感器部分则是起到了将识别检测部分识别到的信息通过电信号转换成显示器上明确的数据，供科研研究。

适配体是指通过体外筛选过程从核酸文库中分离出来的和靶标具有高度特异性的单链DNA或RNA寡核苷酸。适配体能够识别不同类型的分子，在靶标存在的情况下，适配体会优先与靶标结合，结合时所发生的构象变化会导致测量信号的变化[6]。

常用的电化学检测手段主要有：循环伏安法(CV)、差分脉冲伏安法(DPV)、方波伏安法(SWV)、电化学阻抗谱法(EIS)。目前针对OTA检测的电化学适配体传感器的检测手段部分具体参数总结与对比见表1。

表1 基于赭曲霉毒素检测的电化学适配体传感器对比

2 OTA电化学适配体传感器研究进展

目前，电化学适配体传感器可大致分为两大类：标记型和非标记型。标记型中又可以分为电活性分子标记型、纳米材料标记型和酶分子标记型。此外，纳米材料不仅可作为标记材料，也可作为适配体负载材料来增强电信号。

2.1 标记型

标记型电化学传感器是指将电活性分子负载到适配体或检测物上，通过对电活性分子的检测对目标物进行定量检测[16]。在引入电活性分子后，传感器的检测更加灵敏。在三种标记材料中，以氧化还原电活性分子标记型、纳米材料标记型应用较多。

2.1.1氧化还原电活性分子标记型

目前氧化还原电活性分子应用较多的主要分为两大类：一类是以亚甲基蓝(MB)作为标记，另一类是以二茂铁(Fc)作为标记。ABNOUS等[17]以MB作为氧化还原指示剂，采用具有大比表面积和高导电率的单壁碳纳米管(SWCNTs)进一步对电化学信号进行放大的同时，以Apt互补链作为辅助，构建了一种较为稳定的电化学传感器。在没有加入目标物OTA时，Apt与其互补链保持稳定的双链结构；当目标物加入时，因目标物与Apt具有更高的结合力而导致双链裂解，MB和SWCNTs从电极表面脱落，从而使得电化学信号减弱。这种基于CACS修饰电极表面的笼状结构更为牢固，便于信号的检测，但是组装较为复杂。除使用单一电活性物质进行标记外，同时用MB和Fc两种电活性物质标记的双信号传感器也表现出了很好的性能。ZHU等[18]构建的电化学适配体传感器检测限为0.003 3 μg/L。其主要是通过将Fc固定在电极表面的cDNA上，加入适配体与其形成双链，在没有加入标靶时添加MB，则Fc与MB的信号不会发生变化，在加入适配体后再加入MB，会因为电极表面DNA链的构象发生变化，从而负载更多的MB，导致MB的电流信号大大增加，通过对两种电活性分子的电信号对比实现对目标物OTA的电化学检测。此外，在进行真菌毒素检测时，由于部分毒素具有协同作用会导致毒性的增强，所以对其进行同时检测具有重要意义。一起引入MB和Fc不仅可以作为双比例信号检测单一目标物，也可同时标记两种目标物，从而实现对多种目标物的同时检测。ZHU等[19]用Fc标记黄曲霉毒素B1(AFB1)适配体，用MB标记OTA适配体，将其与电极表面的发夹DNA杂交，测其电信号，在加入靶标后，被标记的两种适配体与靶标结合脱离电极表面，导致两种电活性分子的电信号降低。根据其电信号的变化完成了两种目标物的定量检测，AFB1和OTA的检测限分别为1.75、1.08 μg/L。该传感器借助了刚性2D的发夹DNA，极大地提高了传感界面的组装和识别效率，但电极表面的DNA链较长，在组装过程中存在缠绕的风险。

2.1.2纳米材料

纳米材料是一种尺寸很小的结构单元，且具有磁性、光学或导电特性。自20世纪80年代中期问世以来热度一直不减，目前已被应用到包括电化学传感器等多个领域。将纳米材料作为标记物与适配体结合，基于其自身具有的导电理化特性，可以实现传感器的灵敏检测。ZHANG等[20]使用聚多巴胺纳米球(PDANSs)和银纳米粒子(AgNP)合成的纳米复合材料AgNPs@PDANSs作为OTA的电化学示踪剂，通过对PDANS上AgNP的电化学剥离信号实现对OTA的检测，并利用PDANS进行信号放大。在OTA存在下，适配体由于优先与OTA结合，导致适配体表面信号标签减少，降低了AgNP的电化学响应信号。其检测限达到了10-12～10-8μmol/L的宽线性范围和0.57×10-12mol/L的低检出限，且具有良好的重现性，在其他有害物质的电化学分析中具有良好的应用前景。WANG等[21]以HA作为OTA的识别元件，将其固定在电极表面，并将金纳米颗粒(AuNPs)标记的双报告DNA(rDNA1和rDNA2)与HA进行对称杂交，然后进一步利用三硫氰尿酸(TCA)聚合AuNPs实现信号放大。加入目标物OTA后，HA与OTA将会特异性结合形成OTA-HA复合物，导致双报告DNA从电极上脱落，从而促使DPV响应降低。实现了对OTA的灵敏检测，检测范围为0.001～1 μg/L，检出限为0.5×10-3μg/L。

2.2 非标记型

非标记型电化学适配体传感器的检测机制主要是基于靶标和适配体结合会导致构象及空间位阻的变化，造成电极表面的电化学性质发生改变，从而获得电化学检测信号。ZHU等[22]提出了一种以g-C3N4纳米片(g-CNNS)为基底的电化学传感器，利用g-CNNS的类过氧化物酶活性及其高生物相容性，制备了一种无标记型传感器，实现了0.073×10-9mol/L的检测限。该传感体系加入目标物OTA后，OTA的存在诱导了适配体产生构象变化，然后g-CNNS通过pi-pi相互作用与电极上的游离互补链非共价组装，通过捕获的g-CNNS催化过氧化氢(H2O2)的氧化以放大电流信号。LI等[23]使用金属有机骨架(MOF)作为传感器的信号探头，具有高电子电导率的金纳米颗粒(AuNP)掺杂的二硫化钼(MoS2)纳米复合材料作为传感器的基底。在优化的实验条件下，传感器表现出0.05～100 μg/L的线性范围，OTA检测限为0.01 μg/L。纳米材料的使用对构建超灵敏传感器起着至关重要的作用，而纳米材料和具有切割作用酶的同时使用，则可以进一步实现信号的多种放大。WEI等[24]在电极表面负载了双链DNA(dsDNA)后，在加入OTA促使双链解开的同时，又加入了RecJ(f)进行靶标回收实现信号放大，解开的链继续与作为模拟酶的Au@Pt/MIL-101(Cr)反应，重新杂交形成双链，实现在H2O2存在下对苯二酚的催化，导致电信号发生改变，实现对OTA的定量检测。该传感器通过对核酸外切酶的引用，实现了循环切割，不断对OTA进行回收，进一步实现信号扩增，获得了较低的检测限(0.17×10-3μg/L)。基于RecJ(f)策略，LI等[25]构建了一种新型的无标记阻抗型电化学传感器，该研究以壳聚糖/二肽纳米纤维水凝胶薄膜作为电极基底，在上面固定OTA适配体，并引导其与DNA2链进行杂交链式反应(HCR)以固定DNA2链。在目标物OTA的存在下，双链解离为单链，并通过引入RecJ(f)外切酶循环消化单链DNA实现信号扩增，检测限为0.03 μg/L。除核酸外切酶能够通过对循环剪切作用进行信号放大外，DNA酶(DNAzyme)、DNA walker和一些协同作用等在信号放大方面也表现出了优异的性能。WEI等[26]基于DNAzyme和DNA walker设计了一种新型电化学传感器，将OTA适配体与DNA walker杂交形成的双链DNA(dsDNA)和含有腺苷核糖核苷酸(rA)位点的HP固定在电极表面。加入OTA后，OTA与适配体优先结合导致双链解离，含有DNAzyme的DNA walker暴露在电极表面，当引入Ag+时，由于DNAzyme的存在，DNA walker会不断循环剪切电极表面含有rA的HP，从而降低了电极的负电荷密度，进而提高了电子转移速率，导致电信号增强。结果表明，引入Ag+后的峰值电流比不引入Ag+的峰值电流增加4.58倍，在0.001～5 μg/L内表现出良好的线性关系，检测限为0.1×10-3μg/L。

WANG等[27]基于表现出优异的导电性和较大表面积的三维海绵状多孔结构氧化石墨烯海绵(GOS)和金纳米花(AuNF)设计了一种在GOS上负载聚(3，4-乙烯二氧基噻吩)-金纳米花(PEDOT-AuNF)复合材料的无标记电化学适配体传感器，当PEDOT和氧化石墨烯之间的pi-pi填料相互作用，支撑GOS表面的PEDOT-AuNF时，会产生协同效应，为适配体提供第二次扩增，从而实现多重信号放大。该检测技术具有良好的选择性和重现性，检测范围为0.01×10-3～20×10-3μg/L，检测限为4.9×10-6μg/L。

3 结语

在众多传统技术和传感器中，基于OTA适配体的电化学传感器能够脱颖而出，主要是因其操作简单、灵敏度高、选择性和重复性好、成本低等优点。但同时，电化学适配体传感器也存在适配体保存较麻烦等缺点。目前电化学适配体传感器在检测OTA的研究上已经获得了很多进展，随着研究的不断开展与深入，新的传感器构建策略、纳米材料的开发和复合、DNA或RNA链的筛选可以使得电化学适配体传感器在未来具有更大的发展空间。