简析非洲猪瘟病毒快速检测方法研究进展

董红艳

（河北省廊坊市农业农村局 065000）

非洲猪瘟(African Swine fever,East African Swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起，ASFV 是一类复杂的DNA病毒，直径较大，能达到175～210nm。成熟体有两层以上衣壳，外部包裹囊膜。该病毒是现在已知唯一的昆虫媒介DNA病毒。经细胞迭代或血清阻断后可丧失吸附特性。

1 非洲猪瘟的性质及危害

非洲猪瘟（ASF）最早在非洲肯尼亚被发现，目前在非洲、欧洲、美洲的几十个国家流行，在我国东部、东北部和西南部也有非洲猪瘟疫情传播。该病在临床上存在全身出血、发热、神经系统障碍等症状，并有以下几个特点，发病时间短、传染速度快、致死率高等。所有品种、年龄的野猪或家猪一旦接触都可能感染ASFV 病毒，该病对养殖业影响极大，给农民与养殖户的经济效益以沉重打击，还拉动了猪肉价格急剧上涨，抬高了物价，给国家正常的农业生产带来不小损失。

目前，还没有研制出针对ASFV 的特效药，由于ASFV 病毒基因组十分复杂，其不同毒株的基因组长度可能在171～191kb 之间，编码151～166 个阅读框，基本可分为24 个基因型。变异可能性较高，具有逃逸免疫机制，对病毒作用于宿主的过程也不清楚，所以其疫苗研发进度极为缓慢。现今的防控基本以加强隔离、减少接触、屠宰带病牲畜、对养殖地带进行全方位消杀等手段为主。所以，对于ASFV 病毒的早期识别与检测显得极为重要。

2 非洲猪瘟病毒的快速检测方法

2.1 从病原着手实现的检测方法

2.1.1 病毒分离培养检测技术

病毒分离培养检测技术是最传统的检测方法之一，有“金标准”的美誉。操作方法：一般先将疑似的ASFV 样本接种于单核细胞或合适的原代细胞中，培养期间，根据病毒增殖情况可适量添加生长因子、血清等，最终获得分离出来的毒株。对其进行鉴定，一般出现红细胞吸附现象48～72h 后，细胞出现病变情况即可说明疑似样本中含有ASFV。

2.1.2 荧光抗体检测技术

荧光抗体检测（FAT）也是常用的一种检测方式，其特点是较为经济，检测时间较短。原理是使用荧光色素结合抗体检测，将疑似感染的ASFV 样本固定于显微镜下，加入血清，血清中被荧光素标记的抗体即可与样本中的抗原相结合，但由于该方式必须使用显微镜，不能用于现场检验[1]。

2.1.3 红细胞吸附检测技术

ASFV 病毒在对细胞进行感染期间会发生吸附红细胞（HAD）的现象，因此，细胞病变之前能观察到红细胞形成的特殊图像。红细胞吸附检测是世界卫生组织推荐的ASFV 检测方法之一，时间较短，只需要4～10h，但ASFV 病毒中也存在没有HAD 现象的毒株，因此，这种检测技术逐渐被PCR 检测技术所代替。

2.2 核酸检测技术

ASFV 病毒的核酸检测技术分为多种，如PCR 检测技术、荧光定量PCR 技术、微滴数字PCR 技术、LAMP 技术等。

2.2.1 PCR 检测技术

在实验室环境下，PCR 是检测ASFV 病毒应用最广泛的技术之一，该方法简单高效、经济性好，能用于现场检测，该技术根据较为复杂的基因型来设计，因此，能检测出各类基因型的ASFV 病毒，而且这种检测技术不仅能检出宿主样品中的ASFV 病毒，甚至能对携带病毒的昆虫进行检验，敏感性较高。

当PCR 反应结束后，实验人员需要对反应产物进行观察，看是否存在特异性条带物，这一过程需要开启器皿，容易污染成品，造成假阳性的情况。而在临床试验中，样品也有多种成分可能抑制PCR 反应，造成假阴性的结果。因此，在进行PCR 反应前，试验人员需要对疑似感染样品，包括其中的血红素、代谢物、酸性多糖与糖蛋白组分进行预处理。

2.2.2 荧光定量PCR 检测技术

荧光定量PCR 检测技术（qPCR）操作步骤较为简单，试验流程较为方便，检测结果较为准确，该方法即在普通PCR检测技术的基础上进行添加荧光色素或荧光探针，利用荧光来实时监测整个PCR 反应过程，并进行记录。通过这种方法，可以对普通PCR 反应中的样品进行定量分析，使其更加敏感、高效，并且该方法只对ASFV 病毒生效，其他病毒如猪口蹄疫病毒、禽流感病毒等都为阴性。整个检测过程可缩短至1h 以内，检测结果较为准确，极大提高了检测人员的工作效率，为识别ASFV 病毒提供了切实有效的措施。

2.2.3 微滴数字PCR 检测技术

微滴数字PCR 检测技术（ddPCR）是一种新兴技术，对样品的核酸分子进行定量检测，与荧光定量PCR 检测技术相比，该技术不需要绘制标准曲线，检测结果更加准确，目前，该技术被广泛应用于各类动物病毒的检测实验中，邬旭龙等针对K205r 基因组建立的微滴数字PCR 技术，其最低可以达到0.36 拷贝，也不会与其他动物病毒或样品成分发生反应，敏感度较高，检测效率较好。但该方法需要昂贵的检测仪器设备，并有较为严格的专业技术要求，只适合于潜伏期的病毒检测和小规模测试。

2.2.4 LAMP 技术

LAMP 技术是在体外恒温的条件下完成的检测方法，用肉眼即可判断检测结果，避免使用实验仪器，加快了检测速度，降低了检测成本，对其他牲畜病毒也不会发生交叉反应，比较适用于基层现场检测[2]。

2.3 从抗体着手实现的检测方法

2.3.1 ELISA 检测技术

酶联免疫检测技术（ELISA）是世界卫生组织指定使用的抗体检测方法，其特点是方便、快速，并可脱离人工，使用电子设备就能实现大批量检测。在西方，ELISA 技术的使用历史较长，从20 世纪70 年代末就已经开始了。在国内目前的实验室环境多采用间接ELISA 技术进行检测。邬旭龙等利用PK205R 作为包被抗原，建立了一种较为快速的间接ELISA 技术，该技术特异性较高，敏感性也较好，变异系数一般小于10%，优化了反应条件，提高了检测效率。

2.3.2 胶体金免疫试纸检测技术

胶体金免疫试纸检测技术利用胶体金颗粒作为免疫标记，结果可利用肉眼进行分辨，不需要仪器设备，具有快捷方便、效率较高的特点。国内目前的免疫试纸制备已达到较为先进的水平，敏感性高，与其他病毒无交叉反应，在基层或现场的检测环境中拥有较好的前景。林彦星等制备的免疫层析试纸条与进口ELISA 检测技术的临床对比率已达到100%。

2.4 其他病毒检测方法

如免疫印迹检测法，其原理与荧光抗体检测技术类似，敏感度较高，适应性较强，与其他病毒不发生反应。但需求较为苛刻的实验条件与较为先进的仪器设备，不利于基层快速检测。

Abad 设计了一种晶体式生物传感器进行ASFV 病毒的抗体检测，可在半小时内出结果。Luminex 悬浮芯片技术以不同比例的荧光材料标记出不同抗体分子，与感染样品结合后由流式细胞仪进行检测。其敏感度与效率高于ELISA 检测法[3]。

2.5 各类检测方法的优缺点对比

目前，实验室环境中应用最为广泛的还是PCR 检测技术与荧光定量PCR 检测技术，病毒分离培养检测虽然检测结果较为准确，特异性较高，但时间过长，不利于疫情的快速控制。有部分ASFV 毒株不存在吸附红细胞的现象，因此，应与PCR 结合使用。胶体金免疫试纸检测法虽然速度快，适用于基层快速检测，但试纸容易污染，最终结果还应结合PCR 检测技术进行判断。LAMP 技术由于需要打开器皿进行观察，更易造成产物污染，发生假阴性或假阳性现象。

3 结论

非洲猪瘟已在世界范围内大规模传播，有效药与疫苗的研制也遥遥无期，我们要做好打一场防控持久战的准备。一方面，应积极进行ASFV 病毒检测方法的不断探索，提高检测效率，降低检测误差。另一方面，应努力推进疫苗与药物的研发，争取早日攻克这一影响畜牧业发展的顽固病毒。