蜜蜂精液保存研究进展

刘佳霖，罗文华，高丽娇，任 勤，王瑞生

（重庆市畜牧科学院，重庆 荣昌 402460）

蜜蜂是世界上最重要的农业授粉昆虫，但从2006年开始，全世界蜜蜂的种群数量快速下降，导致部分农作物和野生植物得不到充分授粉，对全球农业经济和生态环境产生了一定影响[1,2]。自此，深入开展蜜蜂种质资源保护与开发利用已成为全球养蜂业的重要任务之一。

精液保存技术是蜜蜂种质资源保护与开发利用的关键配套技术，为保护珍贵、优良的蜜蜂种质资源提供技术支撑，加快蜜蜂新品种培育的进程，但效率低、成本高且保存时间较短仍是制约蜜蜂精液保存技术广泛应用的关键难题。由此，本文围绕多年来蜜蜂精液保存的相关研究，综述蜜蜂精液的质量检测方法、保存技术及影响保存的因素，以全面了解该领域的研究现状，为进一步优化蜜蜂精液保存技术、研发适宜不同蜜蜂的精液保存方法提供理论依据，助力实现蜜蜂精液保存技术的广泛应用，推动蜜蜂种业健康、持续发展。

1 蜜蜂精液质量的检测方法

精液质量是影响蜜蜂繁殖的重要因素，决定蜂王的产卵力，也决定人工授精的成败[3]。蜜蜂精液质量的传统检测方法主要有2种：一是使用显微镜统计存活精子或活动精子的数量，计算精子存活率和活力；二是使用人工授精技术将精液注入处女王体内，评价受精后蜂王的产卵情况。精液的镜检准确性较差，而体内检测依赖人工授精技术，耗时长、成本高。由此，科学家们进一步开发了多种检测方法。如利用双荧光染色法测定精子的存活率，通过低渗肿胀试验测定精子质膜完整性，使用荧光显微镜测定顶体完整率和线粒体功能以及利用TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling）技术或凝胶电泳技术检测精子DNA的损伤[3-7]。这些技术的出现为评价不同因素对蜜蜂精液质量的影响提供了技术支撑。研究显示：精液质量体外检测的结果与授精后蜂王受精囊内精子的性能显著相关，表明精液质量的体外检测结果可直接反映蜂王的产卵性能，体外检测技术可有效提高蜜蜂精液质量的检测效率[8]。

精液保存技术的价值在于贮存的精液能用于蜂王的人工授精，精液质量需保证受精后的蜂王能正常产卵。Collins[9]证实精液中精子存活率需超过46%才能满足人工授精的需要。其他研究也发现了相同的结果，精液中精子存活率需超过50%才能保证人工授精后蜂王从春季到冬季正常产卵[10]。由此，成功的精液保存方法应满足精子存活率不低于50%[11]。

2 蜜蜂精液保存技术

蜜蜂精液保存技术根据保存时的精液状态分为非冷冻和冷冻保存技术。非冷冻保存技术，即液态保存技术，是在冰点以上温度贮存精液；精液的冷冻保存技术是在低温冰箱（-20℃和-80℃）或液氮（-196℃）中贮存，保存期间精液维持冷冻状态。在实际贮存时，应根据保存目的选择合适的保存技术，以提高保存效率，降低保存成本。

2.1 蜜蜂精液的非冷冻保存技术

蜂王和雄蜂交尾后将精液贮存在受精囊内，可长时间维持精子活力，这一特性推动了国内外学者开展蜜蜂精液的非冷冻保存研究。1960年，Taber和Blum[12]在冰点以上温度保存蜜蜂精液68 d，随后进行人工授精，蜂王能正常生产受精卵。1970年，Polle和Taber[13]使用硫酸链霉素在13～15℃保存精液35周，人工授精后蜂王能正常产卵并成功培育下一代蜂王。2000年，Collins[14]测定精液在不同温度下保存1～52周后的精子存活率，结果显示25℃和12℃实验组9周时的精子存活率分别为58%和80%，差异显著，随后维持相似的精子存活率至39周。随着研究的不断深入，蜜蜂精液在非冷冻条件下的有效保存时间逐步延长。使用抗生素凝胶包裹的保存管贮存精液，在14℃成功保存439 d，该贮存时间是蜜蜂精液在非冷冻条件下维持正常授精性能的最长保存时间，证实了抗生素在蜜蜂精液保存中的重要作用[15]。

除依赖恒温设备的非冷冻保存，国内外学者也研究了蜜蜂精液在常温下的保存方法。将采集的精液装入微型尼龙管，可在室温（20～24℃）成功保存25 d[16]。Burley等[17]使用含有0.05%双氢链霉素的Kiev溶液（柠檬酸钠2.43 g、NaHCO30.21 g、KCl 0.04 g、磺胺0.30 g、葡萄糖0.30 g和100 mL去离子水）稀释精液，25℃保存5周和6周后精子的存活率分别为83.8%和79.2%。2015年，Collins[18]将新鲜精液移入40μL细管，在室温条件下避光保存，发现随保存时间的延长，精液浓度和人工授精后蜂王生产受精卵的数量逐渐降低，该条件仅适用于精液的短期保存。

2.2 蜜蜂精液的冷冻保存技术

非冷冻保存技术实现蜜蜂精液的短期贮存，但随着贮存时间延长，精液质量逐渐下降，难以长时间保存精液。由此，科学家们参考人类和畜禽精液的保存技术，逐步开展蜜蜂精液的冷冻保存研究，旨在实现蜜蜂精液的长期保存。在研究初期，蜜蜂精液的冷冻保存并不顺利，有效保存时间短，冷冻保存后（冷冻-融化）的精液质量差，导致人工授精后蜂王生产大量未受精卵[19,20]。造成该结果的主要原因是快速冷冻会破坏精子的细胞完整性，导致精子死亡[21]。随后的研究集中于降低快速冷冻对蜜蜂精子的影响，筛选了冷冻保护剂和保存管，优化了降温程序，逐步延长了冷冻保存的有效时间。薛运波等[22]将精液与含有冷冻保护剂的稀释液混合后移入0.25 mL麦管，在13℃平衡10 min、4℃平衡30 min，随后进行预冷冻，将精液放置在液氮罐口下方15 cm处停留20 min，降至25 cm处8 min，在液氮面上方2 cm处停留5 min，最后投入液氮保存。该方法实现了蜜蜂精液长达4年的保存，解冻后精子的活力为0.68。程控降温仪的出现实现了精液从冰点或冰点以上温度到-40～-60℃的程序降温，进一步降低快速冷冻对精液的影响。Paillard等[23]将平衡后的精液放入程控降温仪，设置程序-3℃/min，待精液温度降至-40℃时快速投入液氮保存，保存1年后精子的存活率超过75%，人工授精后蜂王死亡率低，受精囊内活精子数量大。使用冷冻-融化精液进行2代蜂王的人工授精，二代蜂王能正常产卵，表明基于程控降温仪的冷冻保存技术可有效贮存蜜蜂精液，该技术可为开展蜜蜂良种选育、建立种质资源基因库提供关键的技术支撑[24]。至此，蜜蜂精液的冷冻保存技术已趋于成熟，尽管不同研究的保存方法存在差异，但主要步骤基本一致，即采集性成熟雄蜂的精液移入离心管，加入稀释液和冷冻保护剂，轻柔混匀后在4℃平衡1～2 h，移入冷冻保存管，使用程控降温仪将温度降至-40～-60℃，投入液氮保存[23,25]。

虽然基于程控降温仪的冷冻保存技术实现了蜜蜂精液的长时间保存，但该技术对设备的依赖性强，成本高，难以实现广泛应用。因此，探索替代程序降温的预冷冻方法成为近年来的研究热点。Auth和Hopkins[4]将精液放置在液氮上方2.5 cm处，蒸汽浸渍5 min后放入液氮保存，26 d后测定不同实验组精液的质量，结果显示：液氮蒸汽浸渍实验组精子的活力和存活率与程序降温实验组差异不显著。Stucky等人[26]设计了直径较小的精液保存管，使用玻璃化处理进行预冷冻，随后放入液氮保存，6 d和343 d后的精子存活率分别为93.18%和41.46%，且6 d时精子的存活率显著高于程序降温实验组。以上研究表明：液氮蒸汽浸渍和玻璃化处理可作为程序降温的替代方法进行深入研究。

近年来，国内外学者对蜜蜂精液的冷冻保存技术进行了优化。如Wegener等人[27]使用透析技术向精液中混入二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO），冷冻保存后进行人工授精，提高了蜂王生产受精卵的比例，且蜂王受精囊内精子的数量也明显高于其他研究，表明通过透析的方式使用保护剂能提高精液冷冻保存的效果。庄明亮等[25]将精液与稀释液和保护液分2步混合平衡，显著提高冷冻-融化精子的活力和存活率，以及人工授精后蜂王的存活率。这些研究清楚地表明，现有的蜜蜂精液冷冻保存技术仍有一定的发展空间，进一步延长有效保存时间，提高冷冻-融化精液的质量，降低保存成本将是未来的主要研究方向。

3 影响蜜蜂精液保存的因素

3.1 稀释液

稀释液在蜜蜂精液保存、质量评价以及人工授精等过程中必不可少，合适的稀释液需保证人工授精后蜂王正常产卵，同时还能提高精液保存效果，降低离心等操作对精液的影响。稀释液主要包含多种化合物（NaCl、NaHCO3和柠檬酸钠等）、氨基酸、蛋白质、糖、抗氧化酶以及抗生素等，用于冷冻保存的稀释液还需加入冷冻保护剂如DMSO和甘油等。稀释液中的阳离子可作为精子运动的可逆抑制剂，降低精子在贮存过程中的能量损耗[28]；蛋白质能提高冷冻-融化精子的存活率和活力，降低超低温对精子质膜的影响[6,29,30]；抗氧化酶有助于降低外界胁迫对精子的氧化损伤，其中过氧化氢酶基因在雄蜂和蜂王生殖器官以及精液中高表达，表明该酶在保护精液免受氧化损伤的过程中发挥着十分重要的作用[31]。此外，适宜的pH值和渗透压有利于提高精子活力，降低冷冻保存对精液的影响[22,28,32]。

不同稀释液能显著影响蜜蜂精液非冷冻保存的效果。与VarhomⅡ、Ⅲ、甘氨酸缓冲液和椰子水相比，使用Tris缓冲液（Tris buffer 100 mL、NaCl 0.065 g和KCl 0.060 g）在14℃保存9个月的精液，精子运动性能最好，并确定该稀释液的最佳pH值为7.19，表明优化稀释液配方对延长蜜蜂精液的有效保存时间至关重要。稀释液同样能影响蜜蜂精液的冷冻保存效果。Gül等[33]研究显示：与葡萄糖溶液相比，稀释液能改善冷冻-融化精液的质量，提高人工授精后蜂王生产受精卵的比例。与大豆卵磷脂相比，稀释液中加入20%的蛋黄能提高冷冻-融化精子的活力和存活率[34]。Taylor等[35]发现：稀释液并不影响精子存活率，但会对精子活力产生显著影响，使用4号稀释液（100 mL缓冲液包含柠檬酸钠2.43 g、NaHCO30.21 g、KCl 0.04 g、阿莫西林0.03 g和过氧化氢酶200μL）冷冻保存精液的效果优于其他稀释液。

稀释液中加入添加剂能提高精液保存的效果。添加5 mmol/L左旋肉碱L-carnitine可改善冷冻-融化精液的质量，显著提高精子活力、质膜完整性、顶体完整率以及线粒体功能，表明左旋肉碱的抗氧化和抗凋亡作用有助于提高精液在低温下的稳定性[36]。蜂王浆是蜜蜂幼虫和蜂王的重要食物，具有较高的抗氧化活性，稀释液中添加1%的蜂王浆能显著提高冷冻-融化精液的精子活力、顶体完整率及质膜完整性，表明稀释液中加入适量蜂王浆有利于蜜蜂精液的冷冻保存[5]。

3.2 冷冻保护剂

冷冻保护剂能有效降低超低温对蜜蜂精液的影响，提高冷冻-融化精子的存活率及活力，在蜜蜂精液的冷冻保存过程中发挥着十分重要的作用[37]。但冷冻保护剂对精子有毒性，能造成精子损伤，因此筛选有效且低毒的冷冻保护剂也成为精液保存研究的一个重要方向。Al ay等[38]评价了4种保护剂对冷冻-融化精液的影响，结果显示DMSO和乙二醇能显著提高稀释后、平衡后以及冷冻保存后精子的活力，甘油能显著改善冷冻-融化精液的质量，不同保护剂的保护效果由大到小依次为DMSO、乙二醇、甘油和1,2丙二醇，DMSO的最佳浓度为6%。其他研究也获得了相同的结果，DMSO对精液冷冻的保护效果优于其他保护剂，且毒性较低[11,26,35]。为最大限度降低保护剂对冷冻-融化精子的毒性，科学家们优化了保护剂的使用方法。与单一保护剂相比，在相同浓度下同时使用DMSO和乙二醇能提高蜂王受精囊内的精子数量，表明保护剂的混合使用有助于降低单一保护剂对精液的毒性[39]。使用透析技术将DMSO混入精液，能提高蜂王受精囊内精子的数量以及生产受精卵的比例[27]。

3.3 保存管

合适的保存管有利于提高冷冻保存后精液的质量。使用0.50 mL和0.25 mL麦管保存精液，精子活力更高，其中0.25 mL麦管的保存效果最好，其次为0.50 mL麦管以及0.25 mL、0.50 mL、1.50 mL和5.00 mL PCR管[22]。使用抗生素凝胶包裹的保存管能显著延长蜜蜂精液非冷冻保存的有效时间[15]。此外，保存管还能提高精液保存的效率。Stucky等[26]设计了直径较小的精液保存管，结合玻璃化处理简化了冷冻保存过程中的降温程序。

3.4 降温程序

快速冷冻-融化能造成精子不可逆的损伤，优化降温程序一直是蜜蜂精液保存研究的热点[21]。研究显示：程序降温有利于改善冷冻-融化精液的质量，提高保存效果[23]。液氮蒸汽浸渍同样能降低快速冷冻对精子活力及存活率的影响，该预冷冻方法的保存效果与程序降温差异不显著[4]。精液在液氮保存前进行玻璃化处理，6 d后的精子存活率为93.2%，高于程序降温实验组，但随后逐渐下降，在保存343 d后精子存活率为41.2%[11]。此外，精液在0℃以前的缓慢降温也有助于提高冷冻-融化精子的存活率，约为快速降温的6.93倍[11]。

3.5 保存温度

精液对温度敏感，不同保存温度对精液的保存效果产生显著影响[11]。Tarliyah等[40]评价不同保存温度对精子存活率的影响，结果显示：各实验组精子的存活率随保存时间的延长逐渐降低，其中5℃实验组的精子存活率下降缓慢，36 h后的精子存活率高于27℃和37℃实验组。精液与硫酸链霉素混合后在室温（24℃）以及13～15℃下保存13～35周。发现随时间的延长，室温保存的精液质量逐渐降低，使用保存13～17周的精液进行人工授精，大部分蜂王只生产未受精卵，随后精液变质，不能进行人工授精。13～15℃保存35周的精液仍能进行人工授精，且蜂王正常产卵[13]。因此，筛选适宜的保存温度对提高蜜蜂精液的非冷冻保存效果具有十分重要的意义。

目前，精液的冷冻保存主要依赖液氮，保存温度为-196℃。研究显示：-196℃保存蜜蜂精液的效果优于其他冷冻保存温度，且液氮保存效率高、成本低[7]。

4 研究展望

通过60年以上的努力，蜜蜂精液保存技术已趋于成熟，但效率低、成本高且有效保存时间较短仍是制约蜜蜂精液保存技术广泛应用的关键难题。因此，国内外学者应紧密围绕蜜蜂种业未来发展的需要，在下一步的研究中利用新技术和新材料进一步优化蜜蜂精液保存技术，研发适宜不同蜜蜂的精液保存方法，研制专用设备，为保护蜜蜂种质资源、培育优良蜜蜂品种提供更加强有力的技术支撑。

4.1 优化蜜蜂精液保存技术

以延长有效保存时间，提高保存效率和精液质量，降低保存成本为主要目的，对现有技术进行深度优化，获得实用性强、适用广泛的蜜蜂精液保存技术。改良和简化稀释液配方，寻找能有效提高精液保存效果和人工授精成功率的添加剂；优化冷冻保护剂的使用方法，评价新型保护剂在蜜蜂精液冷冻保存中的作用；改良液氮蒸汽浸渍和玻璃化处理等预冷冻工艺，寻找替代程序降温的预冷冻方法；基于3D打印技术设计改良现有的保存管，利用新型材料研发专用保存容器，进一步延长蜜蜂精液的保存时间。

4.2 研发适宜不同蜜蜂的精液保存技术

多年来，蜜蜂精液保存的研究主要集中于西方蜜蜂，而有关其他蜜蜂精液的保存鲜有报道。但不同蜜蜂精液的采集量、浓度、精子数量及理化性质存在一定差异，西方蜜蜂精液的保存技术并不完全适用于其他蜜蜂，导致保存效果差、有效保存时间短[41-44]。为实现多种蜜蜂精液的长期保存，保护全世界蜜蜂遗传资源多样性，下一步应重点研发适宜不同蜜蜂，特别是适宜各地区特色蜜蜂品种的精液保存技术。中华蜜蜂是我国最重要的本土蜜蜂品种，从西方蜜蜂引入我国开始，中华蜜蜂的分布区域和种群数量快速下降[45]。2006年中华蜜蜂已纳入我国畜禽遗传资源保护品种，保护中华蜜蜂已成为我国蜂产业的重要任务之一。目前，有关中华蜜蜂精液保存的研究较少，现有技术存在保存效果差，人工授精后蜂王死亡率高、产卵异常等问题[43]。因此，我国亟待研发适宜中华蜜蜂的精液保存技术，为保护我国珍贵的本土蜜蜂种质资源、推动中华蜜蜂品种改良奠定基础。

4.3 研制蜜蜂精液的专用保存设备

现有的蜜蜂精液保存技术大多使用通用设备，适用性不强，效率低，对精液保存有一定影响。针对蜜蜂养殖及精液保存过程中的实际情况，设计研制蜜蜂精液专用的保存设备，如数控蜜蜂精液保存箱、透析仪、预冷冻设备以及专用液氮保存容器等，能有效提高设备与蜜蜂精液保存技术的适配程度，提高保存效率，延长蜜蜂精液的有效保存时间。