液相色谱法测定鞋类产品中的六种邻苯二甲酸酯

冯徐根，白子竹，黄志丁，鲁彩霞，杨萌

（1.北京市产品质量监督检验研究院国家纺织及皮革产品质量检验检测中心，北京100025；2.国家市场监督管理总局认证认可技术研究中心，北京100020）

邻苯二甲酸酯一般为挥发性低、稳定性高且具有芳香气味或无气味的粘稠油状液体，具有增强聚合物的可塑性、柔韧性和流动性等作用，被广泛用作塑化剂。此外邻苯二甲酸酯具有雌激素活性，可以干扰人体的内分泌，同时具有潜在的致癌、致畸和致突变等危害[1-3]。

我国国家强制性标准GB30585-2014《儿童鞋安全技术规范》[4]中对邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二-（2-乙基己基）酯（DEHP）、邻苯二甲酸二-辛酯（DNOP）、邻苯二甲酸二异壬酯（DINP）、邻苯二甲酸二异癸酯（DIDP）共六种邻苯二甲酸酯进行了限量。ISO/TS16181:2011和国家标准GB/T32440：2015《鞋类鞋类和鞋类部件中存在的限量物质邻苯二甲酸酯的测定》[5]中给出了使用气相色谱-质谱联用仪测定这六种邻苯二甲酸酯的检测方法，但该方法需要同时使用内标物进行分析且仪器分析时间长达34 min，此外DINP和DIDP在气相色谱-质谱联用仪上峰形呈簇峰形态，给谱图分析过程增加了一定难度。

目前检测邻苯二甲酸酯的方法主要有气相色谱法[6]、气相色谱-质谱联用法[7]、液相色谱法[8-9]、液相色谱-质谱联用法等[10-11]，查阅相关文献针对液相色谱法，目前无学者研究过鞋类产品中六种邻苯二甲酸酯的检测，经本试验证明：本方法无需内标物，无气相色谱-质谱联用法检测DINP和DIDP的簇峰现象，检测时间仅为16 min，重复性好，结果可靠，可以满足鞋类产品中六种邻苯二甲酸酯的检测。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：液相色谱仪Agilent 1260 Infinity（安捷伦科技有限公司）；气相色谱-质谱联用仪Agilent 7890A-5975C（安捷伦科技有限公司）；超声波发生器JP-040（深圳市洁盟清洗设备有限公司）。

标准物质、试剂、材料：BBP（标准物质，98.57%，PANPHY）；DBP（标准物质，99.4%，Bepure）；DEHP（标准物质，99.39%，Dr Ehrenstorfer）；DNOP（标准物质，99.29%，Dr Ehrenstorfer）；DINP（标 准 物 质，99.7%，Dr Ehrenstorfer）；DIDP（标准物质，98.41%，Dr Ehrenstorfer）；丙酮（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；正己烷（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙酸铵（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 标准溶液的配制

单种标准储备溶液的配制：分别准确称取0.0200 g的BBP、DBP、DEHP、DNOP、DINP、DIDP，用色谱纯正己烷定容至5 mL，得到六种邻苯二甲酸酯质量浓度均为4000 μg/mL的单种标准储备溶液。

混合标准储备溶液的配制：分别准确移取0.625 mL的六种邻苯二甲酸酯单种标准储备液，用色谱纯正己烷定容至5 mL，得到六种邻苯二甲酸酯浓度均为500 μg/mL的混合标准储备溶液。

标准工作曲线的配制：分别准确移取混合标准储备溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0至5 mL棕色容量瓶中，用色谱纯正己烷定容，得到六种邻苯二甲酸酯质量浓度为10、20、40、60、80、100 μg/mL的标准工作曲线。

1.3 仪器分析条件

色谱柱：Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm×5 μm)流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；进样体积：20 μL；流动相A：二级水，流动相B：甲醇；梯度洗脱程序：0~7 min，20%A等度洗脱；7~9 min，A由20%线性降至0%，保持7 min；二极管阵列检测器，检测波长：226 nm，参比波长：325 nm；定量方法：外标法。六种邻苯二甲酸酯液相色谱图见图1。

图1 六种邻苯二甲酸酯的液相色谱图Fig.1 Liquid chromatogram of six phthalates

1.4 前处理

将样品剪成5 mm×5 mm样块，准确称取2.0 g样品置于具塞三角瓶中，加入40 mL色谱纯正己烷/丙酮混合溶液，置于50℃超声波水浴中萃取1 h。萃取液冷过滤后转移至50 mL棕色容量瓶中，用色谱纯正己烷定容，萃取液经0.45 μm有机相滤膜过滤，使用LC-DAD进行分析。

2 结果分析

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 DAD检测波长的确定

使用二极管阵列检测器对质量浓度为100 μg/mL的六种邻苯二甲酸酯混合标准溶液进行光谱全扫描分析，结果见图2。

由图2可知，BBP在225 nm有最大特征吸收，DNOP在224 nm有 最 大 特 征 吸 收，DBP、DEHP、DINP和DIDP均在226 nm有最大特征吸收，综合考虑确定226 nm作为六种邻苯二甲酸酯的检测波长，同时取325 nm作为参比波长，减少背景干扰。

图2 六种邻苯二甲酸酯二极管阵列检测器紫外吸收光谱图Fig.2 UV absorption spectra of six phthalates

2.1.2 流动相的选择

邻苯二甲酸酯易溶于正己烷、甲醇或乙腈有机溶剂中，本试验设计使用反相色谱柱分析邻苯二甲酸酯物质，而正己烷更适用于正向色谱，所以不考虑正己烷作为流动相，此外甲醇和乙腈的截止吸收波长分别为205 nm和190 nm，对邻苯二甲酸酯检测的干扰较小，所以考察甲醇-水流动相体系和乙腈-水流动相体系对邻苯二甲酸酯检测的影响。结果表明：使用甲醇-水流动相体系时，背景干扰少，峰形更加尖锐且六种邻苯二甲酸酯色谱分离效果更好，所以选择甲醇-水流动相体系。

一般情况下适量的使用无机盐溶液作为流动相可以改善峰形，所以本试验考察甲醇-水流动相体系和甲醇-50 mmol/L乙酸铵水溶液流动相体系对色谱峰峰形和保留时间的影响，结果见图3和表1。

由图3和表1可知，甲醇-水流动相体系和甲醇-50 mmol/L乙酸铵水溶液流动相体系对六种邻苯二甲酸酯色谱峰峰形基本无影响，而甲醇-50 mmol/L乙酸铵水溶液流动相体系会缩短色谱峰保留时间，但考虑到对保留时间影响较小且无明显改善峰形作用，所以本试验选择甲醇-水流动相体系。

表1 不同流动相体系对六种邻苯二甲酸酯色谱峰保留时间的影响Tab.1 Effects of different mobile phase systems on chromatographic peaks retention time of six phthalates

图3 不同流动相体系六种邻苯二甲酸酯的色谱图Fig.3 Chromatograms of six phthalates in different mobile phase systems

2.1.3 柱温的确定

柱温分别选择25、30、35和40℃，考察不同柱温对六种邻苯二甲酸酯色谱峰保留时间和分离度的影响，结果表明：柱温对保留时间影响显著，提高温度会使流动相黏度减小，促使六种邻苯二甲酸酯色谱峰的保留时间提前，提高分析效率。但柱温的升高对BBP和DBP分离度影响明显，对DEHP、DNOP、DINP和DIDP的分离度基本无影响。随着柱温的升高，BBP与DBP的分离度逐渐降低，我们通常认为当分离度≥1.5时，表明两个色谱峰实现了完全分离，当柱温为25℃时，BBP与DBP的分离效果最好，综合考虑确定柱温为25℃，结果见表2。

表2 柱温对六种邻苯二甲酸酯色谱峰保留时间和分离度的影响Tab.2 Effects of column temperature on chromatographic peaks retention time and resolution of six phthalates

2.2 方法线性关系及检出限

以六种邻苯二甲酸酯的浓度为横坐标，色谱峰的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，线性相关系数为0.9962~0.9997。方法检出限采用试剂空白添加标准溶液完成前处理步骤后进行仪器分析，当S/N=3时所对应的浓度为方法检出限，本方法的检出限为1.87~8.92 mg/kg，结果见表3。

表3 鞋类产品中六种邻苯二甲酸酯的标准曲线及检出限Tab.3 Standard curves and detection limits of six phthalates in footwear

2.3 回收率与精密度

回收率采用基体标准加入法，选取4种不同材质的鞋材作为基体，添加三个水平，分别为250、500、1000 mg/kg，每个水平平行测定7次，结果表明：回收率为90.5%~97.7%，相对标准偏差为3.8%~6.9%，满足日常检测要求，结果见表4。

表4 鞋类产品中六种邻苯二甲酸酯的回收率与精密度Tab.4 The recovery rate and precision of six phthalates in footwear

2.4 液相色谱法与气相色谱-质谱联用法同时测定样品的结果比较

通过上述对仪器分析条件的优化，确定了最佳仪器分析条件。选取10种不同材质的样品添加六种邻苯二甲酸酯混合标准溶液，使样品中六种邻苯二甲酸酯的含量均为1000 mg/kg，分别使用液相色谱法和国家标准GB/T 32440-2015中的气相色谱-质谱联用法对10种加标样品进行测定，比较两方法测定结果的区别，结果见表5。

由表5可以看出，液相色谱法测定结果与气相色谱-质谱联用法的测定结果相对偏差为1.6%~5.4%，一致性较好，可以作为鞋类产品中六种邻苯二甲酸酯的另一种检测确证手段。

表5 液相色谱法与气相色谱-质谱联用法同时测定样品中六种邻苯二甲酸酯含量的结果Tab.5 Simultaneous determination of six phthalates in samples by HPLC and GC-MS

3 结论

通过对液相色谱仪检测器波长、流动相体系和柱箱温度的优化，确定了最佳仪器分析条件，六种邻苯二甲酸酯浓度在10~100 μg/mL线性范围内具有良好的线性关系，方法检出限为1.87~8.92 mg/kg，回收率90.5%~97.7%，相对标准偏差3.8%~6.9%，液相色谱法测定结果与气相色谱-质谱联用法的测定结果相对偏差为1.6%~5.4%。试验结果表明：本方法与气相色谱-质谱联用法相比不需要使用内标物即可完成准确定量，并且无气相色谱-质谱联用法检测DINP和DIDP时的簇峰现象，仪器分析时间短，重复性好，结果可靠，适用于鞋类产品中六种邻苯二甲酸酯的检测。