脂肪来源间充质干细胞治疗免疫性皮肤病研究进展

何玉仓 吴含文 杨芳芳 丁思琦 李力群

免疫性皮肤疾病大部分发病原因不详，治疗困难，长年的疾病进程常会给患者生活、心理上造成巨大负面影响。近年来间充质干细胞（mesenchymal stromal cells,MSCs）移植在免疫性皮肤病治疗中的应用备受关注。MSCs是一类可以从人体多个部位获得的多向分化潜能的干细胞，其具有强大的自我更新能力，可以分化为不同组织类型[1]，现今被广泛研究而应用于组织工程。其中的脂肪来源间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stromal cells,ADSCs）相比较于其他干细胞而言，具有来源丰富、取材简单、便于培养、增殖速度快、免疫原性较低等显著的优越性，越来越受到人们的关注[2]。大量的体外和体内实验都证实它们具有强大的抗炎、抗纤维化、抗凋亡和促血管生成作用。ADSCs通过分泌抗炎细胞因子来调节免疫系统，发挥协同作用，使ADSCs移植后的组织修复能力增强，细胞损伤减少[3]。它们所表达的Ⅰ类主要组织相容性复合体，在炎症等情况下可以被诱发表达Ⅱ类主要组织相容性复合体[4]。并且由于人类白细胞抗原（HLA）-DR和共刺激分子如CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD40及其配体CD40L在其表面的表达缺失，使其具有免疫逃避机制[5-6]。各种免疫调节的机制使ADSCs在再生医学方面之外，有了更广阔的用途——免疫性皮肤疾病的治疗。

1 ADSCs的免疫调节功能

ADSCs主要通过两种途径发挥免疫调节功能。一种是直接的，通过MSCs与包括免疫细胞在内的多种细胞间的相互作用发挥免疫调节的作用。ADSCs可以作用于包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞在内的免疫细胞、内皮细胞、前脂肪细胞、造血细胞、神经细胞、周细胞和血管周围的内皮细胞等多种细胞进而发挥免疫调节功能[7]。不仅是有生物活力的MSCs、凋亡的MSCs，甚至MSCs碎片也可以发挥部分的抗炎效应[8]。另一种是间接的，ADSCs分泌多种可溶性介质以及细胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs），作用于靶点来达到减轻炎症反应的目的[9]。这些EVs是由营养物质和前炎症因子组成的，包括了细胞因子、趋化因子、甚至由EVs运载的蛋白质以及miRNAs，EV包括外泌体和微囊泡，可以作为膜与胞浆蛋白、脂质和遗传信息之间转移的载体在细胞之间的通信中发挥作用[10-12]。目前认为，非直接细胞接触是ADSCs发挥免疫抑制效应、促进组织修复再生的主要途径[13]，利用MSCs分泌效应的治疗方法最近也受到越来越多的关注。

2 ADSCs在自身免疫性皮肤病的应用

目前应用ADSCs治疗自身免疫性皮肤疾病的方法有局部给药和全身给药。全身给药的操作简单，常常通过ADSCs静脉注射来实现。ADSCs进入体内后根据局部促炎细胞因子表现出高度的趋化性，定位于炎症组织，可能和ADSCs表达的趋化因子受体4（CXCR4）有关[14]。虽然ADSCs静脉注射的安全性在一期人类临床试验中已经得到肯定[15]，但其存在的其他风险仍未完全明确。局部给药包括皮内注射、混合移植等[16]，具有高效、精准，直击靶点的优点，在实际应用中更具优势。但针对很多全身散在病灶的皮肤病患者而言，局部给药会增加更多痛苦，无法达到根治效果。因此如何选择用药要视患者和疾病本身特点来选择。

2.1 ADSCs用于治疗系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE） SLE是由于免疫复合物沉积造成全身多器官受损的自身免疫性疾病，抗核抗体(ANA)和抗双链DNA常作为怀疑SLE或结缔组织疾病患者的筛选工具[16]。产生IL-17的Th17细胞在小鼠模型中被证实是SLE等多种自身免疫性疾病的促进因素[17]。研究者发现通过ADSCs静脉注射后可以控制Th17淋巴细胞数量和产生IL-17的能力来实现免疫调节，还可以减少Th1、增加Breg细胞、Treg细胞的数量，减轻SLE小鼠蛋白尿和血清的抗ds-DNA抗体、肌酐，减轻肾脏损害以及肾间质的炎性细胞浸润和水肿，改善SLE的炎症指标和临床症状[19-21]。ADSCs的应用就调节Th17/Treg平衡比例上来看，和SLE传统治疗用药环磷酰胺作用效果无统计学差异[22]，这有可能为SLE的治疗提供新方向。

2.2 ADSCs用于治疗特应性皮炎（atopic dermatitis,AD） AD是一种和遗传因素、环境过敏原有关，伴有表皮屏障破坏的多因素、异质性疾病，可伴有炎症反应，以皮肤瘙痒为主要临床表现。AD患者血清IgE水平增高，急性期皮损处Th2细胞显著增高，产生细胞因子如IL-4、IL-13、IL-31等，慢性期可发现Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ升高[23-24]。有学者在犬AD模型中通过系统性注射ADSCs治疗6个月后，原先经过传统治疗（如食谱营养支持、局部治疗、抗菌药物治疗、过敏原特异性免疫治疗、免疫调节药物等）12个月以上无效的病犬的瘙痒程度（1周改善）和犬类AD评分（1月改善）都有显著改善[25]。在NC/Nga小鼠AD模型病变区域内注射自体ADSCs或者自体ADSCs培养基，也能显著减轻小鼠体内炎症因子表达水平和皮损表现[26]。研究表明，局部注射可以诱导神经酰胺和二氢神经酰胺的产生，同样可以减少经表皮水分流失，同时增强角质层水化，显著降低炎性细胞因子水平，并且呈剂量依赖性，进而修复破损的皮肤屏障和抑制皮肤炎症。

2.3 ADSCs用于治疗银屑病 银屑病是一种全身性的、免疫介导的疾病，以皮肤和关节炎症为特征的疾病[27]。银屑病的发病可能和T淋巴细胞在表皮浸润有关，包括Th1和目前认为起关键作用的Th17[28]。T淋巴细胞可以释放刺激角质形成细胞增生的细胞生长因子IL-17 、IL-22、IFN-γ、TNF-α等[29]，使得银屑病患者皮肤MSCs对T细胞增殖的抑制能力减弱。而在编码Th1和Th17细胞因子的大部分基因中有相对更高的表达，所以有观点认为MSCs异常可能是银屑病的发病因素之一[30]。2016年，有研究者尝试在1例寻常型银屑病患者和另1例银屑病关节炎患者静脉注射自体ADSCs，进而发现2例患者的银屑病面积和严重程度指数（PASI）分别都得到了改善。寻常型银屑病患者TNF-α略有降低，并且与银屑病临床症状有关的活性氧浓度也显著降低[31]。无独有偶，另一研究使用富含ADSCs的基质血管碎片单独治疗难治性银屑病患者，经过单次静脉注射后，患者在1个月后银屑病斑块便得到了极大的改善，银屑病面积和严重程度指数评分由基线时的50.4分，在1个月后降至0.3分。12个月内无严重不良事件发生[32]。

2.4 ADSCs用于治疗系统性硬化症系统性硬化症（systemic sclerosis,SSC） SSC也叫硬皮病，是一种免疫介导的风湿性疾病，其特征是胶原和其他基质成分在皮肤和靶器官中的积累导致的皮肤和脏器的纤维化以及血管病变。SSC的早期阶段，细胞浸润主要由Th2型细胞组成，同时伴随血清中TGF-β、血小板源性生长因子和IL-1水平的显著增加，增强炎性反应[33]。研究者在次氯酸诱导的SSC小鼠模型中静脉注射自体ADSCs或人ADSCs后均可看到皮肤厚度减少，Ⅰ型胶原（Col1）、α-SMA转录表达以及皮肤和肺部胶原含量减少。值得注意的是，在减少皮肤纤维化方面，ADSCs注射比骨髓来源的MSCs注射效果更为显著[34]。同时在博来霉素诱导的SSC小鼠模型中，静脉注射ADSCs也可以使皮肤和肺的纤维化减轻；CD4+、CD8+T细胞和巨噬细胞向真皮的浸润减少；皮肤中胶原蛋白和成纤维细胞因子IL-6、IL-13等的mRNA表达减少[35]。另外，通过离心提取富含ADSCs的SVF局部注射治疗SSC手部病变患者时，患者皮肤纤维化，手部水肿，生活质量明显改善，31.6%的活动性手部溃疡在注射后24周愈合，甲襞毛细管显微镜半定量结果得到改善[36]。总的来说，ADSCs在SSC的治疗中，可能通过限制细胞外基质蛋白和增加胶原酶活性来减少纤维化；通过调节基础的肥厚性瘢痕成纤维细胞的细胞外间质重塑；并通过干细胞增殖和分化提供结构支持[37]。

2.5 ADSCs用于治疗天疱疮 天疱疮的发病与针对角质形成细胞黏附分子的自身抗体IgG的产生相关。自身抗体与黏附分子桥粒芯蛋白Ⅰ、桥粒芯蛋白Ⅲ的结合会破坏角质形成细胞的细胞内黏附力，导致棘皮松解和天疱疮中常见的病灶，包括水疱和表皮内脓疱的形成[38]。常见的治疗天疱疮的方法存在较多不良反应，尤其是治疗后的低存活率[39]。2015年有学者报道了1例在使用激素或免疫抑制剂无效的落叶型天疱疮病犬模型中，经过20个月共21次的ADSCs静脉注射治疗，病犬的激素使用量逐渐下降，皮损改善，并且在ADSCs治疗结束后12个月的低剂量泼尼松龙维持治疗中基本无新发皮损[40]。由此提示ADSCs应用可作为辅助治疗天疱疮的新思路，在缓解天疱疮引起的皮肤损伤中具有重要意义。

2.6 ADSCs用于治疗白癜风 白癜风是一种临床上常见的后天性局限性或泛发性皮肤色素脱失性疾病，任何部位皮肤均可发生，但好发于受光照和摩擦损伤部位，如面颈部、躯干部和四肢等部位。其始发因素是各种原因造成的黑素细胞破坏[41]。经过长期研究发现，大量的CD8+T淋巴细胞浸润在白癜风皮损真皮浅层内[42]，并具有黑色素细胞抗原特异性，可以针对性地杀伤黑色素细胞，从而指导角质形成细胞不可逆的凋亡，造成正常皮肤色素减退。这也是导致白癜风发病的可能机制之一。因此如何抑制白癜风皮损周围浸润的CD8+T淋巴细胞，有效调节皮损周围的免疫环境，将成为治疗白癜风的有效手段。Kim等[43]发现与ADSCs共同培养的黑素细胞相比较而言，其向表皮迁移的数量明显增加。这可能与ADSCs可以促进碱性成纤维细胞生长因子、干细胞生长因子分泌等有关[44]。Lim等[45]将不同比例的原代培养的人ADSCs和原代培养的人黑色素细胞移植到SD大鼠和裸鼠中取得良好效果，进一步证实了ADSCs联合治疗肤色恢复的安全性及持久性。这为白癜风治疗提供了一种更有效的新疗法。

2.7 ADSCs用于治疗免疫性脱发 免疫性脱发是由于反应性T细胞的过度活化,毛囊自身免疫赦免的破坏[46-47]引起自身免疫系统攻击毛囊组织，发生脱发。治疗免疫性脱发的传统药物主要为米诺地尔和糖皮质激素类。米诺地尔通过扩张血管、刺激毛囊真皮乳头细胞,促使毛囊进入生长期。糖皮质激素具有免疫抑制的作用,减少免疫细胞对毛囊的攻击，促进毛囊的正常生长。但这两种药物均有明显的不良反应,临床应用具有局限性。有学者将ADSCs和毛囊真皮乳头细胞（DPCs）共培养发现ADSCs可以有效促进DPCs的增殖能力,增强DPCs的分泌功能及DPCs诱导毛囊形成的能力，促进毛囊进入生长期[48]。同时在免疫性脱发小鼠模型中,经ADSCs混合培养基注射治疗，小鼠毛发质量增加,毛发生长情况改善，免疫组化显示ADSCs可以下调毛囊周围的免疫功能,降低局部炎症因子水平[49]。国外也有研究通过随机对照实验验证ADSCs治疗的安全性[50-51],结果显示无严重不良反应发生。ADSCs的应用为治疗免疫性脱发提供良好理论依据和实验基础。

3 小结

自身免疫性皮肤疾病的治疗始终是个亟待研究的难题。目前传统的治疗方案包括糖皮质激素和免疫抑制剂，以对症治疗、延缓病情进展为主。近年来生物制剂也被广泛研究和应用。但是无论是哪种方案，都存在长期使用后不良反应大、成本高昂、易复发等缺点。ADSCs同时具有免疫调节效应与再生作用，在创伤、肿瘤、糖尿病等物理因素造成的皮肤创面修复方面应用价值得到了认同，对于自身免疫性皮肤病的治疗也存在很大潜力。ADSCs的免疫调节作用涉及T细胞、B细胞、单核细胞和NK细胞等，控制免疫细胞的炎症状态，促进免疫细胞产生抗炎细胞因子。ADSCs也可以通过旁分泌功能——分泌可溶性介质和EVs，达到免疫调节的目的。

目前，ADSCs体外诱导和分化技术已经十分成熟，而在生物体内移植后的成活时间却是个难以解决的问题。有研究表明，通过静脉输注ADSCs后，经由接受者的免疫系统抵抗，ADSCs难以在损伤组织维持一个长时间的移植状态[64]。虽然ADSCs也可以分泌可溶性分子达到免疫调节目的，但是往往在几天以后便难以在组织中检测到。并且，由于其固有的生物特性和多样分化的能力，ADSCs是否具有潜在致瘤可能仍未有明确答案。但总的来说，ADSCs在免疫性皮肤病中具有良好的应用前景，值得进一步研究。