低海拔人工饲养条件下喜马拉雅旱獭血液生理生化及性激素指标的测定与分析*

聂金秋 朱庆峰 颜 彬 朱 彬 周顺长 杨东亮 王远志 王宝菊

(1.华中科技大学同济医学院附属协和医院，武汉 430022)(2.华中科技大学实验动物中心，武汉 430030) (3.石河子大学基础医学院，石河子 832000)

喜马拉雅旱獭(Marmotahimalayana)是啮齿目(Rodentia)、松鼠科(Sciuridae)、旱獭属(Marmota)的大型地栖性啮齿类哺乳动物之一，低氧高寒较高海拔的青藏高原及其周边地区是其主要的活动区域[1]，高海拔低氧的生长环境赋予其特殊的生理特征。喜马拉雅旱獭作为一种宝贵的实验资源，深化研究并不断推进其实验动物标准化的进程，有利于实验动物学的发展，也利于生物医学研究中用其作为实验动物模型的建造。近些年来，在国内外多个科研项目中，旱獭频频作为研究人类乙肝病毒和抗核苷酸药物毒性评价等研究的模型动物[2-3]。本文对新疆地区人工饲养条件下不同性别、年龄及饲养时间、喜马拉雅旱獭的血液生理、生化及性激素各项指标进行了测定和统计分析，旨在为喜马拉雅旱獭的健康管理、配种繁育甚至产业化及实验动物标准化等研究提供相应的参考依据。

1 材料和方法

1．1 实验动物

捕捉生长于海拔2 000～3 000 m新疆和田地区的45只喜马拉雅旱獭，雄性旱獭24只，雌性旱獭21只(无妊娠期个体)；3岁龄以下旱獭22只，3岁龄及以上旱獭23只。在捕捉地隔离15 d，所有动物经鼠疫检测阴性，临床检查体健，确认其不携带各类烈性传染病病原体及各类寄生虫，多轮卫生检疫合格后转运至海拔470 m左右的新疆石河子进行低海拔适应性人工饲养。

饲养管理及环境：饲养室内光照一般为自然光照，光照时间强度不足时可由日光灯补充。温度控制在 10～15 ℃，维持相对湿度40%～60%，每日定时启动室内空气输送系统，交互室外空气，尽量保持内外压强及空气氧含量一致，并降低由氨气聚集形成的异味。每日3次定时饲喂；每日食物供给为新鲜可食青草、蔬菜、水果及颗粒饲料的多样组合，其中颗粒饲料营养成分指标为：粗蛋白12%、粗脂肪3%、粗纤维40%、粗灰分6%、水分30%；供给清洁弱酸化水。每日清扫1次室内并充分冲洗笼具中托粪盘；每15 d使用2%过氧乙酸将饲养场地及设施特别是笼具清洁消毒1次[1]。

1．2 方法

1.2.1血样采集：上述动物人工饲养6个月和18个月后各采样1次，采样时间均为10月份。方法为：早晨空腹状态下，人工保定动物，后肢肌肉内注射盐酸氯胺酮进行麻醉，由后肢静脉采集血液，共采集5 mL全血，其中乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2) 抗凝血 2 mL，用于血常规检测，非抗凝血3 mL，分离得血清，用于血清生化指标及性激素指标检测[4-5]，所有样本在采集完毕置于冰盒中后立即送往实验室进行检测[4-5]。

1.2.2血液生理指标测定：应用希森美康XN-1000(B4) 全自动血球细胞分析仪进行血常规检测，全血玻璃涂片镜检和白细胞分类计数采用显微镜下人工计数复核，检测正常血常规指标8项，分别为白细胞(WBC)数、中性粒细胞(NEUT)百分率、淋巴细胞(LYM)百分率、单核细胞(MONO)百分率、嗜碱粒细胞(BA)百分率、红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)和血小板(PLT)。

1.2.3血清生化指标测定：应用强生VITROS 5600全自动生化免疫分析仪(干化学法)进行血生化常规指标检测，检测常用正常血液部分生化指标9项，分别为肝功能参数谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆红素(TB)、直接胆红素(DB)，肾功能参数尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)，以及空腹血糖(GLU)。

1.2.4血清性激素测定：应用罗氏Cobas E602全自动电化学发光分析仪(电化学法发光)进行性激素常规指标检测，检测常用正常血液性激素指标3项，分别为孕酮、睾酮及雌二醇。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 血液常规指标测定结果

通过血常规分析，获得喜马拉雅旱獭血液生理指标数据，统计结果见表1。3岁龄及以上旱獭的血红蛋白(Hb)水平明显高于3岁龄以下旱獭(P<0.05)，而3岁龄以下旱獭的血小板(PLT)水平明显高于3岁龄及以上旱獭(P<0.05)，余血常规各项指标在不同年龄组间的差异均无统计学意义。人工饲养1年以下旱獭的血小板(PLT)水平明显高于人工饲养1年及以上旱獭(P<0.001)，余血常规各项指标在不同饲养年限组间的差异均无统计学意义。不同性别组间血常规各项检测指标的差异无统计学意义。

2.2 血液生化指标测定结果

通过血清血生化分析，获得喜马拉雅旱獭血液血生化指标数据，统计结果见表2。血清生化检测各项指标中，雌性旱獭的血清总胆红素(TB)明显高于雄性(P<0.05),直接胆红素(DB)水平也明显高于雄性(P<0.05)，而雄性的血清尿素氮(BUN)水平明显高于雌性(P<0.05)，余血生化各项指标在不同性别组间的差异均无统计学意义。3岁龄及以上旱獭的血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)及肌酐(CREA)水平明显高于3岁龄以下旱獭(P<0.01，P<0.001)，余血生化各项指标在不同年龄组间的差异均无统计学意义。不同饲养时间组间血生化各检测指标的差异均无统计学意义。

2.3 血液性激素测定结果

通过血清性激素分析，获得喜马拉雅旱獭血液性激素指标数据，统计结果见表3。血液性激素检测中各项指标，3岁龄及以上雌性旱獭的血清雌二醇水平明显高于3岁龄以下雌性(P<0.05)，3岁龄及以上雌性旱獭的血清雌二醇水平显著高于同龄雄性(P<0.001)，相同饲养时间不同性别组间雌性旱獭的血清雌二醇水平均高于雄性(P<0.05)，不同饲养时间相同性别组间血清雌二醇水平的差异均无统计学意义。本次检测中，旱獭血清孕酮水平极低，血清睾酮水平也较低，各组间血清孕酮及睾酮水平的差异均无统计学意义。

表1 人工饲养喜马拉雅旱獭血常规参数与性别、年龄和饲养时间的关系Table 1 The relationship between blood parameters of captive Marmota himalayan and sex, age and feeding time

表2 人工饲养喜马拉雅旱獭血生化参数与性别、年龄和饲养时间的关系Table 2 The relationship between blood biochemical parameters of the captive Marmota himalayan and gender, age and feeding time

表3 人工饲养喜马拉雅旱獭性激素参数与性别、年龄和饲养时间的关系Table 3 The relationship between sex hormone parameters and sex, age and feeding time of the captive Marmota himalayan

3 讨论

喜马拉雅旱獭是具有冬眠特性的高原原生哺乳动物，其生理状态、海拔高度及季节周期关联密切[10-11]，作为可用于研究人类乙肝、脂代谢疾病及药物安全性评价等方面的新型动物模型[6-9]，具有很高的科研价值。在实验动物标准化研究中扩大实验动物资源并实现可持续发展是亟待解决的问题之一，而高原野生动物资源有限且健康状况不明[1]，受地理条件限制，捕捉与运输工作均也存在一定困难和风险，为此我们尝试开展适应性低海拔人工饲养管理旱獭的工作，并测量了实验动物标准化研究中具有重要价值的低创伤指标——血常规、血生化与血清性激素，以判定此环境下实验动物的健康及疾病状态，以探寻更优化的饲养管理与配种繁育模式。

从血常规指标变化分析，机体血小板数目在生成与破坏中保持一定的平衡，系统调控复杂，影响因素众多，其中不同海拔不同适应时间对不同物种血小板数目的影响尚无一致结论[12]。不同海拔高度饲养的SD大鼠、青海湖羊的血小板数目与海拔高度呈负相关[13-14]，藏猪、藏鸡的血小板数目与海拔高度呈正相关[15-16]，有研究报道称，久居高原汉族返回平原1年后血小板水平显著降低[17]，青海旱獭血小板水平随海拔降低有逐步降低的趋势[10]，这与本研究的实验结果在一定程度上相符，随着低海拔适应性人工饲养时间增加，新疆旱獭的血小板数目降低。既往研究报道，多数物种，如昆明犬、北平顶猴、SPF小型猪及四川大熊猫的血小板数目随着年龄的增长而降低[18-21]，青海旱獭血小板数目也有随年龄的增长而降低的趋势[4]，在本研究中，新疆旱獭血小板数目与年龄的关系一致，可能是随着年龄的增长，血小板的破坏会增加，终致血小板数目降低。红细胞与血红蛋白水平反应了机体的载氧能力，研究表明，红细胞及血红蛋白水平多与海拔高度呈正相关[22]，同时也受到年龄的影响，如牦牛血红蛋白水平随年龄的增加而升高[23]。既往研究中青海旱獭随着年龄增长红细胞及血红蛋白水平无明显改变[4]，相较于该研究，本次研究中调整了食物的比例，增加了蛋白质配比，一方面海拔降低虽可能致红细胞及血红蛋白水平降低，另一方面人工饲养条件下食物充足，随着旱獭年龄增加其环境适应能力更强且营养水平改善程度更甚，血红蛋白的合成增加，综合呈现的结果为红细胞水平保持稳定，而血红蛋白水平显著升高。既往研究中青海旱獭外周血中炎性细胞略有波动但大体上可保持稳定[4]，这与本研究中不同性别、年龄及饲养时间组间炎性细胞指标无明显差异的结果基本一致，可能是人工饲养管理下，外部环境更为稳定，饲养房中可能致动物处于亚健康甚至疾病状态的各类因素得到控制，同时营养水平得到保障，旱獭的生理状态更为稳定。

从血清生化指标变化分析，总蛋白、白蛋白、尿素氮及肌酐水平反应了机体蛋白质代谢水平，食物中蛋白质的含量增加，机体总蛋白及白蛋白的合成增加，但同时增加了机体蛋白质分解代谢负担。既往研究中青海旱獭总蛋白及白蛋白水平随着年龄的增长而降低[5]。但相比该研究，本研究中动物食物结构比例优化，蛋白质含量提升。成年旱獭血清总蛋白、白蛋白及肌酐水平更高，雄性旱獭的尿素氮水平也较高，与成年体旱獭及雄性旱獭的体型偏大且营养状态更好不无关系。既往研究报道雌二醇、肝细胞功能及胆红素代谢三者联系紧密，雌二醇水平与胆红素水平呈正相关[24]，同时旱獭在不同季节其血液生化指标可能存在波动[11]，既往研究中青海正常毛色雌雄旱獭总胆红素水平的差异均无统计学意义[5,25]，而10月青海白化雌旱獭的血清胆红素水平显著高于雄性[25]，胆红素指标与肝脏功能、激素波动、食物、适应性等相关，本研究中，人工饲养条件下旱獭饮食统一，雌性旱獭的胆红素水平更高，可能与高雌激素水平有关，也可能与新疆旱獭的体质有关，但也需对动物状态做进一步检查，如开展腹部B超及肝脏穿刺等检查，以排除肝胆系统可能存在的隐性损伤导致的血清胆红素水平升高。既往研究中，青海旱獭在人工饲养条件下饲养年限增加生化指标可基本保持稳定[5]，本研究中，随低海拔适应性人工饲养年限增加，旱獭血清血生化各项指标仍保持稳定，说明喜马拉雅旱獭能适应低海拔地区的人工饲养。

从血清性激素指标变化分析，性激素水平变化贯穿动物的生殖周期，啮齿类动物的血清性激素水平的影响因素众多，如性别、年龄及季节周期等[26]。10月份为赤腹松鼠的繁殖休止期，在10月份赤腹松鼠雌、雄间血清睾酮水平相近，孕酮水平降到最低，雌激素水平雌性高于雄性[27]，与本研究中旱獭性激素各指标的走势大致相似。幼獭长到3岁达性成熟状态[28]，这与本研究中旱獭雌二醇水平与年龄及性别的关系一致。本研究中性别相同饲养时间、不同组间性激素指标无明显改变，而相同饲养时间、不同性别组间差异有显著性的指标仅雌二醇，说明低海拔适应性人工饲养时限对旱獭血清性激素水平的影响比较有限，总体上人工饲养条件下，旱獭生殖激素水平可基本保持稳定。

综上所述，新疆喜马拉雅旱獭表现出较强的环境适应性，在低海拔适应性人工饲养管理下，旱獭会出现了一些适应性改变，如血小板水平降低，但其生理状态总体上可基本保持稳定，且营养状态得到改善。本研究为繁殖休止期旱獭的生理状态判定积累了数据，为了尽可能提升低海拔适应性人工饲养管理的效果，后期可随其生殖周期密切监测相关指标，进而更全面地掌握旱獭的健康状态及生殖规律，以期尽快摸索出低海拔人工繁育及产业化的道路。