液相色谱质谱联用测定中毒样品中河豚毒素

高榕冬，孙磊龙，章敏敏，彭 骢

（揭阳市疾病预防控制中心，广东揭阳 522000）

河豚在世界各地均有分布，我国河豚种类多达40余种，分布在沿海一带。由于河豚具有肉质鲜美、营养丰富等特点，我国在很早以前就有食用河豚的习俗。日本、韩国等国家将河豚鱼加工成各式料理直接食用。河豚鱼某些器官组织中具有毒性很强的河豚毒素，若误食河豚毒素，毒素将作用于人的中枢及外周神经系统，从而导致神经肌肉麻痹，严重的会导致误食者死亡。在我国沿海地区时常会出现河豚毒素中毒事件，同时海豚毒素所具有的剧毒特性在军事、医学等领域也具有十分广泛的应用。目前河豚毒素检测有生物测定法、免疫化学法、仪器分析法等，但是这些检测方法各有优缺点，不能很好地满足河豚毒素的法医鉴定、临床诊断救治、食品安全监控等要求[1-3]。随着液相色谱-质谱联用测定技术的不断成熟，将该技术应用于中毒样品中河豚毒素的测定，可以有效满足实际需求[4-5]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

河豚毒素标准品（纯度为99.3%，Aifa Scientific Co）。甲醇（色谱纯），德国默克；乙腈（色谱纯），德国默克；甲酸（优级纯），阿拉丁科技有限公司；乙酸（优级纯），广州化学试剂厂；乙酸铵（优级纯），广州化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

SCIEX 5500+液相色谱质谱联用仪，美国SCIEX，技术指标如表1、表2所示。PT-MR2100均质机，德国IKA；MSI旋涡混匀器，德国IKA；H2050R医用离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

表1 SCIEX 5500+液相色谱质谱联用仪液相技术指标表

表2 SCIEX 5500+液相色谱质谱联用仪质谱技术指标表

1.3 试验方法

1.3.1 配制工作溶液

选取1 mg的河豚毒素对照品，用甲醇进行溶解配制成标准溶液，溶液浓度为100 mg·L-1，同时将标准溶液放置在4 ℃的冰箱内存放。将河豚毒素标准溶液分别加入到空白的鱼肉与鱼肝中，获得质量分数为0.1～10.0 mg·kg-1实验样品，按照样品处理的方式进行处理，然后进行液相色谱-质谱联用测定河豚毒素。

1.3.2 样品前处理

（1）河豚鱼。①用天平称取2.0 g鱼肉或者鱼肝样品，将样品切碎放置到50 mL的离心管中，同时加入5 mL甲酸-甲醇溶液（1+99）搅拌均匀。②将其放入80 ℃的水浴锅中加热10 min，选择离心速度为10 000 r·min-1的离心机离心5 min，同时用吸管吸取上层的清液2.5 mL。③对溶液的pH值进行调整，确保溶液pH在6～8，同时在溶液中加入40 mg的木瓜蛋白酶。④将溶液进行充分混合之后放置到55 ℃的水浴中进行水解2 h。离心速度为10 000 r·min-1的离心机中离心10 min，然后采用吸管吸取上层的清液2 mL，将其放置到另外一个离心管中。在该离心管中加入2 mL的石油醚并振荡30 s，进行离心操作将有机相舍弃。⑤将1 mL的样品提取液上样到经过甲醇和水活化后的固相萃取柱后，依次采用3 mL的水溶液、3 mL的甲醇溶液淋洗萃取柱。通过真空抽取的方式来抽干萃取柱1 min，然后采用3 mL含有2%三氟乙酸的水溶液进行洗脱处理。⑥采用吸管吸取 2 mL洗脱液，经过旋转蒸发仪蒸干之后，用1 mL的甲酸-甲醇溶液（1+9）溶解残渣，用0.22 μm的滤膜进行过滤处理，最后对处理后的溶液进行液相色谱-质谱联用分析。

（2）血样。全血样于冷冻离心机离心3 min，取上层血清（或血浆）0.1 mL至塑料离心管中，加入 0.9 mL乙腈，涡旋振荡2 min，于冷冻离心机 10 000 r·min-1离心5 min，上清液全部转移至另一塑料离心管，下层加入0.9 mL乙腈再提取1次，合并乙腈层，提取液置于40 ℃氮吹仪上吹干，准确加入0.50 mL乙腈复溶剩余物，过0.22 μm滤膜后上液相色谱-质谱联用仪分析。

（3）尿样。静置，过0.22 μm滤膜后直接上液相色谱-质谱联用仪分析。

（4）洗 胃 液/呕 吐 物。洗 胃 液/呕 吐 物 于 5 000 r·min-1离心3 min，取上清液2 mL，加适量氯化钠，加2 mL乙腈，以下前处理步骤同血样处理。

1.4 色谱-质谱条件

（1）色谱条件。色谱柱选择Phenomenex Kinetex C18（100 mm×3.0 mm，2.6 µm），流动相的流速为 0.2 mL·min-1，色谱柱室温范围为20～25 ℃，进样量为5 μL，表3为梯度洗脱程序。

表3 梯度洗脱程序

（2）质谱条件。质谱条件为电喷雾正离子源，电离电压为4.5 kV，毛细管的温度为350 ℃，碰撞的能量为25 eV，鞘气流为1.4 bar，辅助气流为 0.003 L·min-1，采用MS1、MS2、MS3全扫描质谱仪进行分析。在上述色谱、质谱条件下对质谱参数进行优化，将河豚毒素的母离子与两个子离子组成两对母离子/子离子对，具体如图1所示。

图1 河豚毒素二级质谱图

2 结果与分析

2.1 样品处理方式选择

一般而言，含复杂基质样品并不能直接进行液相色谱质谱分析，必须经过处理将样品中的内源性蛋白、脂质、盐类等各种杂质去除。目前对生物样品的处理主要有液液萃取、固相萃取、蛋白质沉淀等方法，考虑到河豚毒素具有比较强的极性，不溶于弱极性有机溶剂，能溶于pH值为3～7的弱酸性水溶液，因此采用固相萃取的方式来对含复杂基质样品进行预处理。采用固相萃取对生物样品进行前处理主要包括选择蛋白沉淀剂、确定蛋白沉淀剂和样品的比例等多个方面的内容，通过科学选择蛋白沉淀剂以及合理确定蛋白沉淀剂与样品的比例来优化样品处理方法。通过比较不同沉淀剂对蛋白的沉淀效果，发现1%的甲酸甲醇溶液沉淀效果最好；血样、尿液、胃液可通过静置、离心、乙腈提取的方法得到较满意的结果。

2.2 色谱柱选择

河豚毒素分子结构特点具有比较高的极性和水溶性，如果采用离子对色谱法进行分离，就无法使用液相色谱-质谱联用分析仪，方法中采用由美国菲罗门公司生产的Kinetex系列C18的液相色谱柱，该色谱柱具有更高的灵敏度和分离度，线性速度和耐压范围更宽，对各种生物性样品，如血液、尿液、胃液等具有更强的适应性。通过一定比例的梯度洗脱程序，能够有效使得亲水性物质和杂质做到完全分离。实际的实验结果表明选择Phenomenex Kinetex能够取得良好的效果。

2.3 河豚毒素测定方法选择

在空白血液中添加10 ng·mL-1河豚毒素，对添加河豚毒素的空白血液进行多反应监测，获得多反应监测色谱图，如图2所示。

图2 多反应监测色谱图（空白血液添加10 ng·mL-1河豚毒素）

用吸管吸取空白的血液和尿液，对血液和尿液样品进行预处理，并进行空白血液和尿液的多反应监测，获得多反应监测色谱图，如图3所示。由图3可知，空白血液河豚毒素出现波峰的地方（2 min处），检测色谱强度比较大，未出现比较大的响应；空白尿液河豚毒素出现波峰的地方（7 min处），检测色谱强度比较大。由此可知空白基质不会产生干扰，河豚毒素测定方法选择是良好的。

2.4 线性关系

在空白的血液、尿液、胃液中加入适量的河豚毒素，将其配制成含有河豚毒素2～100 ng·mL-1的血液、尿液、胃液样品，并且对血液、尿液、胃液样品进行分析处理。以河豚毒素含量作为横坐标，峰面积作为纵坐标，对峰面积y与河豚毒素含量x之间的关系采用最小二乘法进行回归分析。定义检出限为河豚毒素定性离子对峰强度信噪比大于3的含量，定量限为河豚毒素定性离子对峰强度信噪比大于10的含量。表4为血液、尿液、胃液3种基质中河豚毒素测定结果。由表4可知，血液、尿液、胃液中河豚毒素在线性范围内具有良好的线性关系，能够有效满足对生物检材河豚毒素测定的分析 要求。

表4 血液、尿液、胃液3种基质中河豚毒素测定结果

2.5 精密度分析

在化学实验中多次测定值之间的接近程度被称为精密度，通过精密度能够有效反映测定结果重现性的优良。为了对中毒样品中河豚毒素测定精密度分析，分别在空白血液、尿液、胃液中加入适量的河豚毒素，配制成含有河豚毒素的低质量浓度（8 ng·mL-1）的血液、尿液、胃液，含有河豚毒素的中质量浓度 （50 ng·mL-1）的血液、尿液、胃液，含有河豚毒素的高质量浓度（80 ng·mL-1）的血液、尿液、胃液各10份，并且对不同质量浓度的血液、尿液、胃液进行预处理。根据当天标准曲线来计算不同样品中的河豚毒素含量，获得10份样品的相对标准偏差，将其作为日内精密度值。采用同样的实验方法重复测定3 d，计算相对标准偏差，将该数值作为日间精密度值，实验结果如表5所示。

表5 血液、尿液、胃液3种基质河豚毒素精密度

由表5可知，不论是血液、尿液还是胃液，伴随着河豚毒素添加量的增加，其日内精密度值和日间精密度值均呈现下降的趋势，即生物基质中河豚浓度越高，其多次测定值之间的接近程度越高；生物基质中河豚毒素浓度越低，其多次测定值之间的接近程度越低。

2.6 回收率与基质效应

采取和精密度分析一样的方法来制备血液、尿液、胃液，并对制备的样品进行预处理。采用液相色谱质谱联用分析仪测定河豚毒素的峰值面积A1，相同基质的空白样品经过预处理后，在经溶剂吹干的残留物中加入河豚毒素对照品，制备相应质量浓度的溶液，采用液相色谱质谱联用分析仪测定河豚毒素的峰值面积A2，那么提取回收率为

另外，取相同量的对照品溶液吹干，采用流动相定容法进行采样，通过液相色谱质谱联用分析仪测定目标物的峰面积A3，那么基质效应为

河豚毒素具有相对比较强的极性，其只能溶于弱酸性的水溶液，这使得不同生物样品的杂质溶得比较多，从而出现比较大的基质抑制效应，详见表6。另外，在蛋白沉淀的过程中河豚毒素的溶解性相对比较差，很容易被已经沉淀的蛋白质杂质吸附，这也将对河豚毒素的提取回收率产生一定的影响。

表6 血液、尿液、胃液3种基质河豚毒素的回收率与基质效应

3 结论

河豚毒素作为小分子化合物中剧毒的非蛋白质神经毒素，在多种海洋生物体中广泛存在。本文通过对血液、尿液、胃液、鱼样等生物样品进行静置离心、乙腈提取、固相萃取等方法处理，采用Phenomenex Kinetex C18色谱柱进行分离，构建了采用液相色谱质谱联用仪测定河豚毒素的方法。该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便快捷等优点，为生物材料以及各种水产品中河豚毒素的测定提供科学依据。