程序性细胞死亡蛋白1/程序性细胞死亡配体信号通路在结核病免疫调控中的研究进展

刘琪 梁建琴

结核病是严重威胁人类健康的主要传染性疾病之一，全球及我国疫情依然严峻[1]。结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)的免疫识别、免疫应答和免疫调节决定了结核病的发生、发展和结局[2]。所以，近年来结核病免疫调控及免疫治疗成为研究热点。程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)，也称为程序性死亡受体，是一种重要的免疫抑制分子，为免疫球蛋白超家族成员，最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来[3]。程序性细胞死亡配体(programmed cell death ligand,PD-L)包括程序性细胞死亡配体1(programmed cell death ligand-1,PD-L1)和PD-L2，通常与PD-1结合发挥作用，也可作为靶点发挥免疫调节作用[3]。PD-1/PD-L1、PD-L2通路的免疫调节作用对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义[4]。目前根据PD-1/PD-L1、PD-L2通路研发的抗肿瘤单抗药物在临床应用中取得显著的治疗效果[5]。研究发现，PD-1/PD-L1、PD-L2通路在结核病的免疫应答中发挥着重要作用。本文就PD-1/PD-L1、PD-L2的结构和功能及其在结核病发生发展和转归过程中的免疫调控作用进行综述。

PD-1/PD-L1、PD-L2的结构与功能

PD-1也称作PDCD1和CD279，是由PDCD1基因编码的288个氨基酸残基组成的相对分子质量为50 000～55 000的Ⅰ型跨膜蛋白，属于 B7-CD28 受体超家族[3,6]。它的结构包括4 个部分：免疫球蛋白可变区(IgV)、跨膜区、免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs,ITIM)、免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptor tyrosine-based switch mo-tifs,ITSM))，其在骨髓细胞、树突状细胞、自然杀伤(natural killer, NK)细胞、单核细胞、胸腺CD4-CD8-双阴性细胞、调节性T细胞、B细胞以及抗原呈递细胞(antigen-presenting cell,APC)等多种免疫细胞表面均有表达，两个基序是PD-1发挥免疫抑制功能必需的受体[7-8]。PD-1有两个配体分别为PD-L1(CD274)和PD-L2(CD273)，它们分别是由290个与270 个氨基酸残基组成的Ⅰ型跨膜蛋白，同属于B7家族，并且具有37%的同源序列。PD-L1由IgV和IgC样胞外区、跨膜区、短的胞质尾区3个部分组成，在抗原呈递细胞、非淋巴器官和多种肿瘤细胞上表达[9-10]。虽然PD-L1与PD-L2都是PD-1的配体，但PD-L2 表达范围相对较窄，而且主要表达在树突状细胞、单核细胞等免疫细胞上。PD-1/PD-L1信号通路的激活广泛参与T细胞的激活、增殖和凋亡等一系列过程，抑制T细胞介导的细胞免疫反应，是目前研究的热点。PD-1/PD-L1的异常活化及表达在肿瘤的发生发展、慢性感染、自身免疫性疾病中起着重要作用。

PD-1/PD-L1信号通路在结核病免疫应答中的作用

一、PD-1/PD-L1通路在结核病肺泡巨噬细胞中的作用

肺泡巨噬细胞可以清除肺泡表面的细菌，同时保护呼吸系统免受微生物感染[11]。肺泡巨噬细胞通过抑制人或动物体内的PD-1/PD-L1信号通路，对MTB感染的先天免疫反应的初始阶段起重要作用，PD-1/PD-L1信号通路高表达与MTB感染之间存在相关性[12-13]。(1)在感染MTB的肺泡巨噬细胞中，PD-1和PD-L1水平升高，丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)，又称蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)和哺乳动物靶标雷帕霉素(mammalian trget of rapamycin,mTOR)水平降低。AKT和mTOR具有宿主抗菌功能，AKT和mTOR水平的抑制是CD4+T细胞激发宿主广泛功能损伤的显著因素[14]。推测AKT和mTOR水平降低有助于MTB在激活的肺泡巨噬细胞中的存活[15]。(2)H37Rv和卡介苗(BCG)感染可以促进M1巨噬细胞的功能，从而提高CD11c、CD16和CD86蛋白水平和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)、白细胞介素17(interleukin-17,IL-17)、IL-2、IL-6、IL-17A和γ-干扰素(IFN-γ)的分泌，提高活性氧(reactive oxygen species,ROS)的阳性水平。TNF-α在MTB感染过程中对巨噬细胞的活化、凋亡以及趋化因子和细胞因子的产生起重要作用[16]。TNF-α通过NF-κB激活上调PD-L1水平，PD-L1可以介导NF-κB信号通路，参与MTB感染的免疫应答[17-18]。IL-17A具有通过诱导自噬并动员嗜中性粒细胞激活巨噬细胞消灭MTB的作用[19]；IFN-γ主要由激活的CD4+T细胞、CD8+T细胞等产生，对MTB感染的控制起重要作用[20]；IL-2 主要作用是促进CD8+T细胞活化为细胞毒性T细胞，具有杀灭MTB的功能[21]。IL-2与IFN-γ具有协同作用，IFN-γ、IL-2激活巨噬细胞通过氧依赖途径杀死MTB[22]，同时可促进 Th1 细胞增殖，Th1 细胞免疫在抵抗MTB过程中起到了决定性的作用[23]。IL-6抑制IFN-γ诱导的结核分枝杆菌H37Rv感染巨噬细胞自噬；ROS的产生是宿主细胞对MTB入侵最早的先天免疫反应之一，因为氧自由基能够抵御病原体在组织中定植，从而杀灭MTB[24-25]。(3)阻断PD-L1有助于增加体外抗原特异性CD8+T细胞对IFN-γ激活的巨噬细胞的细胞毒性。在感染MTB的肺泡巨噬细胞中，B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)水平升高，Bcl-2水平降低，而抑制PD-1/PD-L1信号通路时，可以发生逆转作用。Bax作为Bcl-2家族的促凋亡成员，通过与Bcl-2同源二聚作用介导细胞凋亡[26]。Bcl-2蛋白家族调控细胞凋亡，参与组织稳态、发育和维持免疫[27]。Bcl-2的细胞保护作用来自于其抵抗Bax的能力，从而阻止肺泡巨噬细胞的凋亡。

推测PD-1/PD-L1信号通路促巨噬细胞凋亡的原因可能是，PD-1和PD-L1的相互作用导致PD-1胞内结构域的ITIM和ITSM磷酸化，使T细胞抗原受体(T cell antigen receptor,TCR)信号通路中的蛋白脱磷酸化，并抑制TCR下游的磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositol 3-kinase,PI3K)、PKB、mTOR、大鼠肉瘤(rat sarcoma,RAS)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulatory protein kinases,ERPK)等信号通路，进而抑制相关基因的转录，阻碍巨噬细胞周期的进程和相关蛋白的表达，使Bcl-2中的促凋亡和抗凋亡蛋白表达比例失衡而导致巨噬细胞的凋亡[28]。以上结果表明，抑制PD-1/PD-L1信号通路可以增强肺泡巨噬细胞对MTB的先天免疫反应，可能会减弱肺泡巨噬细胞中的MTB，提示其有可能成为结核病治疗的新靶点。

二、PD-1/PD-L1 通路在结核病不同T细胞亚群中的作用

PD-1被确定为一种新的免疫衰竭标志物，可抑制效应T细胞反应[29-30]。最近在HIV、丙型肝炎病毒和结核病等传染病中观察到PD-1与其配体之间相互作用在抑制T细胞反应中的作用[31-36]。人类研究的数据显示，PD-1在结核病发病机制中具有免疫抑制作用[36-37]。PD-1/PD-L1在结核病患者的T细胞、B细胞和单核细胞上表达均增强，阻断PD-1/PD-L1通路可促进T细胞增殖和IL-2、IFN-γ等细胞因子的分泌，诱导Th1反应以控制胞内MTB，有效的抗结核药物可以降低PD-1的表达水平[37-38]。

研究表明，PD-1+和PD-L1+细胞频率不仅在CD4+T细胞上显著提高，而且在不同的CD4+T细胞亚群上也显著提高[39-40]。(1)有效药物治疗后，反应性T细胞和效应性T细胞的PD-1表达均下降，即随着结核病治疗的成功，CD8+T、CD4+T和NK细胞上PD-1的表达下降，为PD-1在结核病发病机制中的免疫抑制作用提供了强有力的证据。(2)PD-1在调节性T细胞(Treg)亚群上的表达在治疗前后均无差异，说明PD-1在Treg发育和功能维护中具有特殊作用。 Treg是一类具有显著免疫抑制作用的以表达叉头框P3(forxhead boxP3, Foxp3)转录因子、CD25、CD4为细胞表型特征的T细胞亚群，它能够抑制其他细胞的免疫应答，在维持自身耐受、自身稳定中起了极其重要的作用，PD-1介导的Treg细胞对同种异体T细胞具有抑制作用[39-40]。研究表明，PD-1/PD-L1通路可能通过一种新机制负向调控Treg增殖及其抑制功能，包括阻止IL-2驱动信号传导及转录激活蛋白5(signal transducer and activator of trascription 5, STAT5)磷酸化的机制[41]。在活动性结核病患者中，CD4+CD25-T细胞(Tresp)和CD4+CD25+Foxp3-低表达的效应性T细胞(Teff)亚群上PD-L1的表达高于健康人群，但其确切作用尚不清楚。阻断富集Treg细胞上表达的PD-1可以恢复保护性细胞因子(如IFN-γ)的产生，而且在Treg细胞上抑制PD-1的表达可防止产生T细胞的抗原特异性IFN-γ的凋亡。(3)PD-L1在树突状细胞上增加，对Treg细胞的增殖有促进作用[42]。PD-1对Treg细胞的上调可能与肺结核中Treg的增殖有关。此外，经过有效抗结核治疗后临床改善与Tresp和Teff细胞中PD-1表达的明显降低相关，但在Treg细胞上PD-1的表达不明显。因此，研究PD-1/PD-L1通路在不同 T细胞亚群中的表达特征和动态变化，可用作预测抗结核治疗临床疗效的候选药物。CD4亚群中PD-1/PD-L1通路的调节可能为结核病的控制提供免疫治疗靶点[43]。

不同结核病分类中PD-1/PD-L1、PD-L2信号通路的免疫调控作用

一、PD-1/PD-L1、PD-L2 信号通路在结核性胸膜炎中的作用

一项有关结核性胸膜炎的研究显示，当胸膜间皮细胞(pleural mesenchymal cells,PMC)与来自不相干供体的胸膜CD4+T细胞共培养时，CD4+T细胞的增殖可以被抑制，而与抗PD-L1和(或)抗PD-L2单抗共培养可消除PMC诱导的抑制，这表明PD-1/PD-L1、PD-L2途径抑制了CD4+T细胞的增殖，而未表明PD-1/PD-L1、PD-L2途径以影响CD4+T细胞的凋亡。与漏出性积液相比，结核性胸膜炎的PMC的PD-L1、PD-L2表达要高得多，而且IFN-γ不仅上调了PD-1在CD4+T细胞上的表达，而且上调了PD-L1、PD-L2在PMC上的表达。因此，IFN-γ有可能作为结核性胸膜炎的诊断标志物[44]。

有数据显示，PD-1单抗促进了CD4+T细胞黏附，而没有上调相应的细胞黏附分子和血管细胞黏附分子受体，说明PMC上的PD-1/PD-L1、PD-L2通路选择性抑制CD4+T细胞的增殖和黏附活性。在结核性胸膜炎中，PD-1的浓度、CD4+T细胞上PD-1的表达以及PMC上PD-L1、PD-L2 的表达都增加了，并且MTB特异性抗原刺激释放IFN-γ也促进了结核性胸膜炎中PD-1/PD-L1、PD-L2 的上调[45-46]。

二、PD-1/PD-L1、PD-L2信号通路在粟粒性肺结核中的作用

由PD-1介导的异常/过度抑制可能会损伤宿主对MTB的免疫力，从而导致粟粒性肺结核。在分枝杆菌抗原的作用下活化Th1细胞产生IFN-γ和TNF-α，这对巨噬细胞活化和控制细菌复制至关重要[47]。各种T细胞亚群和抗原呈递细胞之间的作用对于诱导T细胞反应很重要。

和健康对照组比较，在粟粒性肺结核支气管肺泡灌洗液中表达PD-1、PD-L1和PD-L2阳性CD3 T细胞明显升高，表达PD-L1阳性CD19 B细胞明显增加，说明PD-1和PD-L1 对粟粒性肺结核病变部位的局部免疫反应抑制起着关键性作用。阻断PD-1通路，粟粒性肺结核患者的外周血和支气管肺泡灌洗液中MTB特异性T细胞的凋亡明显减少。这表明PD-1在结核病患者肺部病变环境中的过度表达诱导效应T细胞凋亡率升高。

在粟粒性肺结核患者病变部位，PD-1选择性地抑制具有保护作用的MTB特异性T细胞，反而使产生抑制性IL-4因子细胞免受损伤，从而使局部免疫功能状态更加恶化，破坏了保护性Th1反应，抑制宿主免疫力，导致无法在粟粒性肺结核的病变部位引发足够水平的效应免疫。阻断PD-1后，粟粒性肺结核患者的支气管肺泡灌洗液中产生抗原特异性IFN-γ的T细胞增加是最明显的，这表明PD-1介导对产生IFN-γ的效应T细胞的抑制程度最高，PD-1与产生IFN-γ、TNF-α和IL-2和加快细胞凋亡的细胞数量减少有关。阻断PD-1通路后明显提高了产生TNF-α因子和IFN-γ因子CD4+T细胞的频率，可明显提高粟粒性肺结核患者支气管肺泡灌洗液中的多功能T细胞(IFN-γ/TNF-α和IFN-γ/IL-2)水平。抑制PD-1通路不仅恢复了产生单个细胞因子的T细胞，更重要的是恢复了粟粒性肺结核病变部位的多功能效应T细胞。阻断PD-1/PD-L1通路会恢复保护性T细胞反应。因此，MTB通过PD-1/PD-L1、PD-L2通路改变粟粒性肺结核病变部位的Th1和Th2平衡，逃避宿主免疫应答，从而有利于疾病播散[48]。阻断PD-1/PD-L1、PD-L2通路有利于粟粒性肺结核患者的免疫力恢复和疾病的康复，将成为未来控制和治疗粟粒性肺结核的新方法。

PD-1/PD-L1、PD-L2通路对结核病治疗的影响

一、PD-L1 抗体可抑制结核病复发

有研究显示，结核病治疗后CD4+T细胞表面的PD-1表达降低[49]。结核病治疗强化期PD-1、PD-L1和PD-L2表达下降，治愈的结核病患者血液中PD-L1和PD-L2表达细胞的频率降低，每个细胞的PD-L1和PD-L2表达减少[38]。另一项研究同样显示，在活动性结核病患者中，PD-1在B细胞、单核细胞和T细胞表面的表达升高，化疗可导致PD-1通路的负向调节[37]。孙萌萌等[50]利用功能性PD-L1单抗阻断巨噬细胞介导的 PD-1/PD-L1通路，研究其对小鼠结核治疗后复发的免疫干预作用和机制。结果显示，小鼠感染H37Rv 2周后，当异烟肼和异烟肼联合PD-L1单抗分别治疗4周之后，肺、脾和肝荷菌量均较模型对照组明显降低，肉芽肿样病变也明显减轻，但是两个治疗组之间差异无统计学意义。而在复发期，相比较于异烟肼治疗组，异烟肼联合PD-L1单抗治疗组能够明显降低复发期组织荷菌量，减轻病理改变。可见，PD-L1 抗体能促进结核感染的巨噬细胞凋亡，显著抑制结核病复发；但目前尚不完全清楚结核分枝杆菌潜伏感染、健康接触者和结核病患者PD-1表达差异不大，但在结核病治疗2个月后PD-1表达却明显下降的原因，推测可能是由于结核病患者表达PD-1的CD4+T细胞凋亡明显增多，随着抗原刺激的去除，凋亡T细胞逐渐从循环中消失，并且需要更长时间才能补充；CD8+T细胞PD-1 水平随着结核病治疗的成功而下降，其下降方式比CD4+T细胞更明显，但程度低于NK细胞。

二、有效抗结核强化治疗可抑制PD-1/PD-L1表达

活动性结核病和分枝杆菌感染导致PD-1/PD-L1在NK细胞上的表达更高，从而导致其效应功能(如细胞因子的产生)受到抑制[36]，在强化治疗阶段，NK细胞和T细胞显示出从免疫系统抑制中恢复，发挥其效应功能，结核病明显好转。另一项研究也发现同样的机制，即NK细胞PD-1表达水平与新诊断结核病患者的MTB负荷相关，治疗可致PD-1表达下降[51]。PD-1表达可导致产生IFN-γ的NK细胞的凋亡，但不会导致产生IL-4的细胞凋亡。在小鼠体外实验证实，PD-1通过抑制Th1细胞因子分泌和T细胞发育的T盒转录因子、GATA结合蛋白3(GATA-3)和转录调节因子Eomesodermin来影响CD4+和CD8+T细胞效应器功能[52]。在结核病治疗有效的强化阶段，外周血中PD-1/PD-L1 在T细胞和NK细胞的表达下降，这种下降的程度可能取决于每种细胞类型在结核病免疫反应中的作用。与结核分枝杆菌潜伏感染者相比，活动性结核病患者中的PD-L1表达较高，有效的强化抗结核治疗可以抑制PD-1/PD-L1信号通路作用的发挥。

三、PD-1/PD-L1、PD-L2抗体可导致MTB再激活

通过对PD-1基因敲除小鼠的研究表明，感染MTB的小鼠的存活率降低[53-55]。可能是由于PD-1敲除动物中异常升高的炎症反应，伴有过度的中性粒细胞浸润和坏死，对其生存产生致命影响[56]。有研究发现用一种对PD-1具有高亲和力的单克隆抗体以不同剂量阻断PD-L1和PD-L2的相互作用，反而促进了MTB的生长，而这种生长可以通过应用抗TNF-α抗体而发生逆转，这证实了过量的TNF-α是PD-1抑制剂引起MTB生长加快的主要驱动因素[57]。PD-1/PD-L1通路抑制剂的剂量依赖性可能在促炎反应和抗炎反应之间起到微妙的平衡作用。这种平衡是不引起病理改变的必要条件。不同的模型也证实，过量的TNF-α会引起炎症反应；有研究表明，TNF-α抑制斑马鱼巨噬细胞和人肺泡巨噬细胞的MTB生长[58-59]。而在人类细胞中，过量的TNF-α可以增加MTB的生长[60-61]。在活动性结核病患者中，MTB特异性T细胞的TNF-α表达增加与影像学表现严重程度具有相关性[62-65]。同样，使用PD-1阻断剂治疗癌症患者后发展成为肺结核的病例已有报道，例如，鼻咽癌患者在使用PD-1阻断治疗后死于播散性结核病；Merkel细胞癌患者中检测MTB特异性免疫反应阳性，该患者发展成为PD-1/PD-L1检查点阻断剂相关联的结核病；晚期非小细胞肺癌患者使用PD-1抑制剂后合并肺结核，患者在接受Pembrolizumab 单抗药物免疫治疗后发展成为肺结核，可能是在免疫功能低下状态，PD-1抑制剂进一步抑制免疫细胞功能所致[66]；Lee等[67]对霍奇金淋巴瘤患者使用PD-1抑制剂使结核病再激活，表明PD-1在结核病不同阶段的稳态作用被打乱。在接受抗PD-1治疗后，血液中产生IFN-γ的MTB特异性CD4+T细胞增多，并且几个月后出现了结核瘤，表明阻断PD-1通路可促进Th1功能过表达，可能会增加人类结核病的风险或严重程度[68]。综上，阻断PD-1/PD-L1、PD-L2通路可引起异常升高的炎症反应，导致MTB再激活。进一步深入探索PD-1/PD-L1通路抑制剂的治疗剂量，维持促炎反应和抗炎反应之间的平衡，防止MTB再激活而导致结核病发生恶化进展，将是未来研究的重点内容。

总结和展望

PD-1/PD-L1、PD-L2通路在调控结核病的发生发展和转归中起着重要作用。阻断PD-1/PD-L1、PD-L2通路可能会增强病变部位保护性T细胞作用(包括多功能T细胞)，或可修复结核病患者的宿主免疫反应。过度使用PD-1抑制剂可能会破坏PD-1/PD-L1、PD-L2通路对免疫细胞的调控作用引起免疫病理损伤。未来，随着对PD-1/PD-L1、PD-L2通路免疫调控作用机制的深入探索，PD-1、PD-L1、PD-L2有可能作为生物标志物来监测结核病患者的宿主免疫力和疫苗保护力，同时监测PD-1及配体的动态变化，可用于评估结核病的治疗指标。因此，PD-1/PD-L1、PD-L2通路作为免疫检测点在结核病中的免疫调控机制以及在结核病免疫治疗中的潜在应用价值还值得更深入研究，以期能为开辟结核病诊断和治疗新方法提供新思路。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献刘琪：文献检索和文章撰写；梁建琴：文章指导和审校