干姜和炮姜高效液相色谱指纹图谱与色度值对比研究

余凌英，李星，强梦琴，蔡平君（成都中医药大学药学院，西南特色中药资源国家重点实验室，成都 611137）

干姜是姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的干燥根茎。炮姜是干姜的炮制加工品，具有温经止血、温中止痛作用，用于阳虚失血，吐衄崩漏，脾胃虚寒，腹痛吐泻。《中国药典》2020年版中干姜和炮姜的指标成分为6-姜辣素（又称6-姜酚），只是含量限度有所不同[1]。有文献报道干姜和炮姜的6-姜酚成分含量差异较大[2-4]，并通过指纹图谱分析干姜与炮姜峰个数差异[5-7]。指纹图谱结合化学模式识别越来越多地应用于中药材的不同产地、不同炮制品、不同品种等研究[8-10]。炮姜炮制程度主要通过性状颜色主观判断，市场上的炮姜颜色深浅不同，其他指标如含量测定仅规定6-姜酚最低含量，对炮姜质量评价不足，故临床实际应用的炮姜性状差异较大。王维皓等[11]研究结果也表明来源于市场的炮姜相似度较低。目前评价炮姜质量的指标并不完善，本研究通过对炮姜色度值检测、建立指纹图谱结合化学模式识别分析，筛选炮姜质量差异标志物，并对市售炮姜进行验证，以期为进一步评价炮姜质量提供依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-2030C 3D 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；CR-400 色彩色差计（日本柯尼卡美能达公司）；BP110S 十万分之一分析天平（德国Sartorius 公司）；KQ-300E 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；QE-100 高速中药粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）；5 型多功能炒货机（常州迈斯机械有限公司）。

1.2 试药

姜酮（批号：18070502）、6-姜烯酚（批号：19052704）、8-姜烯酚对照品（批号：19072304）、10-姜烯酚（批号：19080802）对照品（纯度＞98%，成都普菲德生物技术有限公司）；6-姜酚（批号：21010402）、10-姜酚（批号：20070809）（纯度＞98%，成都市卓谱仪器有限公司）；8-姜酚对照品（批号：CHB180305，纯度＞98%，成都克洛玛生物科技有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，美国Sigma 公司）；冰乙酸（色谱纯，成都市科隆化学品有限公司）。10 批干姜饮片（G1～G3产地四川；G4～G6 产地云南；G7～G10 产地贵州），经成都中医药大学兰志琼副教授鉴定为姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的干燥根茎。10 批炮姜（自制，采用河砂于195 ℃炒制7.5 min即得，编号P1～P10）。7 批市售炮姜购买于企业、药店（编号为S1～S7）。

2 方法与结果

2.1 色度值测定

2.1.1 测定方法与条件[12]测量光源为D65，视场选择近似2°观察角。分别取各炮制品粉末（过三号筛）适量，将样品粉末置于色彩色差计中，测定样品粉末颜色，平行测定3 份，经白板校正后，测得各样品L*、a*、b*。其中L*代表明暗度，正值偏亮，负值偏暗；a*为红绿色，正值偏红，负值偏绿；b*为黄蓝色，正值偏黄，负值偏蓝。

2.1.2 样品测定与分析 取干姜和炮姜样品，按“2.1.1”项下测定条件测定样品L*、a*、b*，总色值（E*）＝（L*2＋a*2＋b*2）1/2，总色差（ΔE*）＝（ΔL*2＋Δa*2＋Δb*2）1/2，ΔL*、Δa*、Δb*分别是炮姜与同批次干姜数据的差值。其中10 批干姜和炮姜样品检测结果见表1，市售炮姜样品检测结果见表2。从表1数据可以看出：干姜L*为65.56～76.88，a*为3.35～7.74，b*为31.29～36.38，E*为73.67～84.23； 炮 姜L*为34.56～44.30，a*为12.82～14.39，b*为25.68～31.37，E*为45.10～56.04。干姜制成炮姜后ΔL*、Δb*均为负值，平均分别下降了34.09和5.01，表明炮姜颜色明显偏黑；Δa*为正值，平均增加8.96，样品偏红；ΔE*平均增加35.68，色差明显，干姜与炮姜可以明显区分。

表1 干姜和炮姜色度值检测结果Tab 1 Chromatic values of dried ginger and processed ginger

从表2数据可以看出市售炮姜L*、E*均高于样品炮姜，表明市售品颜色比样品炮姜颜色明亮，色泽偏黄。市售炮姜a*、b*均有1 份样品检测数据在样品炮姜数据范围内。S3、S4 两份样品色度值与样品炮姜最接近，但仍高于样品。

表2 市售炮姜色度值检测结果Tab 2 Chromatic values of processed ginger from market

2.2 指纹图谱的建立

2.2.1 色谱条件 InertSustain AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈（A）-0.1%乙酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，10%～25%A；10～30 min，25%～40%A；30～70 min，40%～80%A；70～83 min，80%～90%A；83～98 min，90%～100%A）；检测波长280 nm，柱温30℃，流速0.6 mL·min－1，进样量10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 取姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为0.0602、0.294、0.129、0.093、0.295、0.060、0.048 mg·mL－1的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 分别取干姜和炮姜粉末（过三号筛）约0.30 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，称定质量，超声（功率250 W，频率40 kHz）处理40 min，取出，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 精密度试验 取“2.2.3”项下溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录各共有峰的峰面积，结果各共有峰峰面积的RSD值为0.50%～0.72%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 稳定性试验 取“2.2.3” 项下溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样测定，记录各共有峰的峰面积，结果共有峰峰面积的RSD值为0.47%～1.2%，表明样品在24 h 内稳定。

2.2.6 重复性试验 取炮姜粉末6 份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按 “2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录各共有峰的峰面积，结果各共有峰峰面积的RSD值为1.4%～2.8%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 指纹图谱的建立及相似度评价 取10 批干姜和炮姜饮片按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，将10 批干姜和10 批炮姜色谱图分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A 版）”软件进行相似度评价，干姜的相似度为0.918～0.993，炮姜的相似度为0.904～0.993，相似度均大于0.9。10 批干姜和10 批炮姜饮片HPLC 指纹图谱见图1，干姜的共有峰为25 个，炮姜的共有峰为27 个，其中峰2、21、23 为干姜的特有峰，峰1、3、5、16、28 为炮姜的特有峰。通过对照品指认了其中7 个色谱峰，结果见图1。

图1 干姜（A）、炮姜（B）、混合对照品（C）HPLC 图Fig 1 HPLC chromatogram of dried ginger（A），processed ginger（B）and mixed reference substance（C）

2.3 统计分析

以炮姜确定的27 个共有峰为研究对象，采用SPSS 26.0 软件对10 批干姜与10 批炮姜中共有峰的峰面积数据均一化处理后与色度值L*、a*、b*、E*进行独立样本t检验分析，结果见表3。炮姜与干姜相比，色谱峰4、6、7、12（6-姜酚）、13、14（8-姜酚）、15（6-姜烯酚）、18（10-姜酚）、19（8-姜烯酚）、24（10-姜烯酚）、26、27、29 等13 个峰的峰面积差异有统计学意义，其中峰4、13、15、19、24、27 炮制后峰面积明显增加。峰1、3、5、16、28 为炮制后新产生的成分。色度值L*、a*、b*、E*差异均有统计学意义，其中L*、b*、E*在炮制后显著降低，a*在炮制后显著升高。

表3 干姜和炮姜峰面积、色度值平均值t 检验结果Tab 3 t test of mean peak area and chromatic value of dried ginger and processed ginger

2.4 聚类分析

利用SIMCA 14.1 软件，以10 批干姜和10 批炮姜的HPLC 指纹图谱的色谱峰面积标准化处理后进行聚类分析，结果见图2。当平方欧氏距离为20 时，10 批干姜聚为一类，10 批炮姜聚为一类，说明不同炮制品之间质量存在明显的差异。

图2 聚类分析树状图Fig 2 Dendrogram of cluster analysis

2.5 主成分分析

将10 批干姜及10 批炮姜饮片HPLC 指纹图谱中的27 个色谱峰的峰面积及色度值（L*、a*、b*、E*）经数据处理后导入SIMCA 14.1 软件中进行主成分分析，部分批次色谱峰缺失的峰面积以0 计。当特征值＞1 时，共提取5 个主成分因子，其特征值和方差贡献率见表4，前5 个主成分可用于反映干姜和炮姜指纹图谱整体93.13%的信息。主成分分析二维得分图见图3，干姜与炮姜被明显地分在坐标轴的两侧，互不交叉，说明干姜和炮姜具有明显的差异性，与聚类分析结果一致。

图3 干姜和炮姜的主成分分析得分图Fig 3 Score plot of principal component analysis for dried ginger and processed ginger

表4 特征值及方差贡献率Tab 4 Characteristic value and variance contribution rate

2.6 偏最小二乘-判别分析

为了进一步寻找干姜和炮姜的差异标志物，采用SIMAC 14.1 软件对样品数据进行偏最小二乘-判别分析。将10 批干姜和10 批炮姜的27 个共有峰的峰面积和色度值（L*、a*、b*、E*）导入SIMAC 14.1 软件中，建立偏最小二乘-判别分析模型，模型得分图见图4，所得结果与主成分分析和聚类分析结果均一致，可以很好地将两者进行分类。其中R2Y达到0.978，表示模型拟合程度好，Q2达到0.944，表示该模型预测能力强。10 批干姜和10 批炮姜饮片的分类聚集明显。对模型中31 个变量的重要度（VIP）进行分析，结果见图5，选择VIP ＞1 的成分作为区分干姜和炮姜饮片的重要特征数据，依次为a*（VIP＝1.39）、L*（VIP＝1.39）、E*（VIP＝1.38）、峰3（VIP＝1.32）、峰29（VIP＝1.28）、峰5（姜酮，VIP＝1.25）、峰14（8-姜酚，VIP＝1.23）、峰6（VIP＝1.22）、b*（VIP＝1.21）、峰12（6-姜酚，VIP＝1.20）、峰18（10-姜酚，VIP＝1.20）、峰16（VIP＝1.17）、峰28（VIP＝1.17）、峰15（6-姜烯酚，VIP＝1.16）、峰7（VIP＝1.09）、峰1（VIP＝1.07）、峰24（10-姜烯酚，VIP＝1.06）、峰13（VIP＝1.04）。

图4 偏最小二乘-判别分布图Fig 4 Score plot of partial least

图5 VIP 值分布图Fig 5 VIP score plot squares-discriminant analysis

2.7 差异标志物与色度值相关性分析

利用SPSS 26.0 对14 个差异标志物峰面积与色度值L*、a*、b*、E*进行相关分析，结果见表5。一般认为，相关系数|r|≥0.8 时高度相关；0.5 ≤|r|＜0.8 中度相关；0.3 ≤|r|＜0.5 时低度相关；|r|＜0.3 时基本不相关。除13 号峰与b*不相关外，其余各色谱峰与色度值均有相关性，其中峰1、3、5、15、16、24、28 与a*成显著正相关，与L*、b*、E*成显著负相关；峰6、7、12、14、18、29 与之相反，与a*成显著负相关，与L*、b*、E*成显著正相关。表明干姜炮制过程中，差异标志物与颜色变化有较好的相关性。

表5 差异标志物峰面积与色度值相关性分析Tab 5 Correlation analysis between marker peak area and chromatic value

2.8 市售炮姜数据分析

将7 批市售炮姜饮片按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。将市售炮姜与炮姜对照指纹图谱进行相似度评价，S1～S7相似度分别是0.617、0.593、0.746、0.795、0.580、0.512、0.565，相似度均小于0.8。根据“2.5”项下筛选VIP ＞1 差异标志物的色谱峰，以其峰面积分别与样品姜（建立指纹图谱的干姜、炮姜）峰面积进行比较，其与干姜峰面积差异有统计学意义，其与炮姜峰面积差异有统计意义的是峰5、6、12、14、16、24、28。市售炮姜峰面积与样品炮姜对比，范围不同的色谱峰有峰5、16、28，全部重叠的色谱峰为峰7、13，峰面积比较见表6，色谱图见图6。

图6 市售炮姜色谱图Fig 6 HPLC fingerprint of processed ginger from market

表6 市售炮姜与样品炮姜差异标志物峰面积比较Tab 6 Marker peak area between processed ginger from market and processed ginger

市售炮姜色度值与样品炮姜有差异，相似度也较低；差异标志物峰面积部分成分有差异，采用不同条件炮制炮姜，成分变化未达到样品炮姜的炮制程度。

3 讨论

本研究考察了不同提取溶剂（50%甲醇、75%甲醇、甲醇）、不同流动相（乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液）、不同检测波长（240、254、280 nm）、不同流速（0.6、0.8、1.0 mL·min－1）对色谱图的影响，最终确定了研究用色谱条件。

本研究对干姜和炮姜指纹图谱进行了相似度和化学模式识别分析。两种炮制品相似度均＞0.9，表明炮制品各批次间成分差异不明显，质量相对稳定。市售炮姜相似度在0.512～0.795，炮姜来源不同质量差异大，可能与炮制工艺参数不一致，在炮制过程中化学成分变化程度不同有关。采用化学模型识别分析与相似度评价结果基本一致，说明本研究采用的分析方法用于炮姜质量评价是可行的。

基于VIP ＞1 的筛选原则，发现了14 个化学成分可作为区分干姜和炮姜的标志物，并指认了姜酮、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚和10-姜烯酚等6个成分。14个成分中，色谱峰1、3、5、16、28 为新增加成分，市售炮姜中峰5、16、28 峰面积均低于样品炮姜，表明上述成分可能与炮制程度关系更密切，是炮制程度潜在评价指标。5 号峰为姜酮，具有抗炎、抗氧化、止血等作用[13-16]，是炮姜温经止血成分之一，姜酮含量与炮制温度、时间均有关系[17]。炮姜中姜酚类成分含量降低，姜烯酚类和姜酮成分含量增加，其变化可能与姜酚类成分在炒制过程中转化为姜烯酚、姜酮等物质有关[18-20]。姜烯酚类成分抗炎作用强于姜酚类[21]。课题组对脾胃虚寒型胃溃疡大鼠进行抗溃疡实验，优选工艺制得样品[22]药效优于炮制太过或不及的样品。说明以差异标志物作为质量评价指标是科学的。

颜色是传统中药质量评价的指标之一，辨色论质经过长期的发展应用，有丰富的理论，但主观性强，缺乏客观标准。颜色量化值能反映炮制品颜色变化，通过比较粉末与饮片的色度值，粉末均匀，重现性好，选择粉末为本研究对象进行实验，检测数据与差异标志物关联。结果表明炮姜色度值与差异标志物有明显相关性，可以通过表观颜色推测内在成分高低，评价炮姜质量。市售炮姜数据也说明以色度值作为炮姜质量评价指标具有合理性，且操作方便、快捷，为炮姜质量快速评价以及在线监测提供了思路，但是合适的色度范围还需要扩大样本量，进一步检测分析确定。

综上，建立的干姜和炮姜HPLC 指纹图谱并结合色度值、化学模式识别分析，将外观颜色与内在质量进行了关联，明确了炮制品质量差异，为炮姜质量评价提供了参考。初步分析了质量差异标志物与炮制程度的关系，但需要深入研究相关性；其他未知标志物，有必要进行进一步研究，如采用HPLC-MS-MS 等技术研究结构与功效，并确认标志物的合理控制条件，有利于更全面地评价炮姜质量。