饲料中添加太子参提取液对大黄鱼血液免疫指标的影响

黄伟卿，汤桂津，吴秀珠，刘 铮，林培华，阮少江，郭团玉，宋 炜

(1.宁德师范学院生命科学学院，福建宁德 352100；2.闽东水产品精深加工福建省高校工程研究中心，福建宁德 352100；3.福建省宁德市鼎诚水产有限公司，福建宁德 352100；4.厦门海洋职业技术学院海洋生物学院，福建厦门 361000；5.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090)

大黄鱼(Larimichthyscrocea)属鲈形目(Perciformes)石首鱼科(Sciaenidae)黄鱼属(Larimichthys)，主要分布在我国南海、东海和黄海南部，为暖水性集群洄游鱼类，生活于近海的中、下层，因其具有肉质细嫩，味道鲜美，营养价值高等特点，深受广大消费者的青睐[1-2]。20世纪70年代，大黄鱼海上捕捞量高达12万t，位于我国四大传统鱼类的主捕对象之首[3-4]。后因过度捕捞，大黄鱼种质资源日渐匮乏，濒临枯竭。为对大黄鱼种质资源进行保护，1985年水产科技人员利用福建省宁德市官井洋为大黄鱼内湾性产卵场，在第6个国家五年计划期间突破了大黄鱼亲本保活、驯养、人工育苗等技术瓶颈，首创大黄鱼全人工繁养技术。经过30多年的发展，2020年其产量达22.6万t，居海水养殖鱼类之首，成为我国八大优势出口养殖水产品之一，是最大规模的海水网箱养殖鱼类[4-8]。但近年来，大黄鱼养殖过程中不仅存在着人工配合饲料的开发和应用水平较低问题，还存在以鲜杂鱼为主要饵料不仅容易滋生病菌引发病害，而且还会恶化养殖环境，导致大黄鱼感染刺激隐核虫等寄生虫病，继而感染弧菌等细菌性疾病等问题，导致大黄鱼的死亡率升高，严重制约大黄鱼养殖产业的发展[9-11]。在治疗大黄鱼疾病方面，以抗生素治疗所取得的效果最佳，但抗生素类药物终身残留，并随着食物链的富集作用，最终会对人体产生毒副作用[12]。自中国共产党第十九次全国代表大会以来，畜牧绿色现代化养殖已成为民生健康和食品安全问题，成为养殖业的关注热点，人们迫于寻求绿色健康的替抗药品，中草药因其天然、低残留和不易产生耐药性的特点，已得到广泛关注并开展大量的研究[13-14]。已有多位学者证实，在饲料中添加黄芩、黄连、穿心莲、大黄、金银花、黄芪、丹参等单方或复方饲料能够有效提高水产动物的免疫活性[15-18]。

太子参(Pseudostellariaheterophylla)是一种常见的药食两用中药材，富含太子参多糖类、环肽类、皂甙类、氨基酸、微量元素等活性物质，具有益气健脾，抵抗疲乏劳累、对抗应激反应、增强机体免疫力等作用[19]。目前太子参及其产物在畜牧业中已有较多应用，吴建华等研究报道，太子参须使仔猪机体巨噬细胞的吞噬活性得到提高，网状内皮系统的吞噬功能增强，明显提高了机体对疫苗的免疫反应[20]。都广礼研究表明，太子参能有效提高家禽的免疫力，具有抗击禽流感的作用[21]。阮少江等将太子参提取液作为大黄鱼的饲料添加剂，结果表明，太子参对促进大黄鱼的抗病、生长、形体性能和肌肉品质均有一定的促进和改良效果，但对大黄鱼免疫的影响还未见深入探究[22-23]。

血液参与生命体主要的代谢过程，维持机体内部环境的稳定，血液指标是否正常经常用于衡量生物体是否健康[24-25]。此外，通过测定鱼类血液中白细胞的吞噬功能，可以了解其免疫状况[26]。本试验利用太子参的药效功能，将太子参提取液添加至饲料中，通过定期测定血液免疫指标，研究其对大黄鱼免疫的影响，以期为开发提高大黄鱼品质、抗病性、产量和食用安全的绿色人工配合饲料添加剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用鱼：大黄鱼购于宁德市鼎诚水产有限公司，挑选体形完整、活力好的幼鱼，平均体长为(10.70±1.63) cm，体质量为(12.73±5.48) g。

太子参下脚料提取液的制备：采用热水浸提法提取太子参提取液，选取太子参根须，洗净，常温风干，研磨成粉，过60目筛，分别取8.75 g粉末于4个锥形瓶中，加入200 mL蒸馏水，于95 ℃的恒温水浴锅中浸提4 h，经抽滤、浓缩、煮沸灭菌后定容至350 mL，制得40 mg/mL的太子参提取液，将该提取液保存于4 ℃冰箱中备用。

试验用饲料：采用海马牌大黄鱼人工配合饲料(粗脂肪含量≥6.0%，粗蛋白含量≥45.0%赖氨酸含量≥2.8%，粗灰分含量≤14.0%，粗纤维含量≤5.0%，钙含量为1.0%～3.0%，总磷含量≥1.0%，氯化钠含量为0.5%～3.0%，水分含量≤10.0%)。

1.2 试验设计

试验于2019年9月在宁德师范学院生物实验楼循环水养殖实验室进行，设置不添加太子参提取液的为对照组，以添加太子参提取液(浓度：40 mg/mL)添加量分别为0.5%(C0.5)、1.0%(C1.0)、1.5%(C1.5)、2.0%(C2.0)为试验组。每组设置3个平行试验，每组300尾大黄鱼幼鱼。

1.3 养殖管理

采用循环水养殖系统养殖大黄鱼，养殖水体溶氧量保持在5 mg/L以上、pH值范围为7.9～8.2、水温保持在23.5～24.5 ℃、盐度在20～28之间、氨氮含量保持在0.20 mg/L以下；于每日09：30及18：00饲喂饵料，每次饲喂饵料为鱼体体质量的 1%～2%，并根据大黄鱼具体摄食情况酌情调整；每日保活吸污、按时换水、捞取死鱼并做好养殖记录。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 血清的制备 正常摄食饵料，幼鱼饲喂15、30、60、120 d后，对试验组、对照组每组随机取3尾进行尾静脉采血，采血量为2 mL，血液静置于室温下1 h，待其凝固后，放到4 ℃冰箱中，冷藏4 h后取出，于高速冷冻离心机中离心，条件为4 ℃、4 000 r/min，时间为10 min，收集血清用于后续相关指标的测定。

1.4.2 大黄鱼血清免疫球蛋白(IgG)含量的测定 选用南京建成生物工程研究所的IgG试剂盒，以免疫比浊法进行测定。

1.4.3 大黄鱼血清免疫酶活性的测定 血清超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定：选用南京建成生物工程研究所的SOD检测盒(货号：A001-1)以黄嘌呤氧化酶法，又名羟胺法的相关步骤进行操作。

血清过氧化氢酶(CAT)活性的测定：测定所用试剂盒来自南京建成生物工程研究所(货号：A007-1)，按可见光法的相关步骤进行测定。

血清溶菌酶(LZM)活性的测定：选用南京建成生物工程研究所的LZM试剂盒(货号：A050)，以空白对照法进行测定。

1.4.4 大黄鱼吞噬细胞吞噬功能的测定 将金黄色葡萄球菌(Staphyloccoccusaureus)经转管培养后，同生理盐水制成相应的菌悬液，经灭活后存入4 ℃冰箱内保存备用，在不同的饲喂时间随机从各试验组中取3尾大黄鱼进行抽血，注意使用肝素钠抗凝剂防止血液凝固，后将血液与菌悬液混合，制成血涂片，并用碱性美蓝染色，后经洗涤晾干，便可进行观察。根据白细胞所具备的相关特点，准确找到30个白细胞，数出吞噬细菌的白细胞数和白细胞吞噬金色黄葡萄球菌数。计算公式[25]如下：

吞噬百分率=观察白细胞总数中参与吞噬的白细胞数/观察数×100%；

吞噬指数=吞噬的的细菌总数/观察数。

1.5 数据统计与分析

数据分析采用SPSS 23.0处理软件中的单因素方差分析，用Duncan’s多重比较分析差异显著性，试验数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 添加太子参提取液对大黄鱼血清IgG含量的影响

对照组和C0.5组在养殖周期内，血清中IgG含量呈现在15～30 d先上升，30 d后下降，至60 d后再上升的趋势；C1.0和C2.0组血清中IgG含量呈现为先上升后下降的趋势；C1.0组饲喂60 d后，血清中IgG含量趋于平稳；C1.5组血清中IgG含量呈现在 15～30 d时先下降，30～60 d时上升，而后又下降的趋势。饲喂60 d，试验组血清中IgG含量随添加太子参提取液浓度的增加呈上升趋势。饲喂30 d时，C1.0组血清中IgG含量达到最高，为(0.42±0.06) g/L。除120 d外，试验组血清中IgG含量均高于对照组(图1)。

2.2 添加太子参提取液对大黄鱼血清免疫酶活性的影响

饲喂添加太子参提取液120 d，各试验组血清中SOD活性变化情况见图2-A，LZM活性变化情况见图2-B，CAT活性变化情况见图2-C。其中各组的SOD活性、对照组和C0.5和C2.0组血清中的LZM活性、对照组血清中的CAT活性均呈现先上升后下降再上升的趋势，而C1.0和C1.5组血清中的LZM活性、C0.5、C1.0和C1.5组血清中的CAT活性呈现先下降后上升的趋势，C2.0组血清中的CAT活性呈现在15～30 d时先下降，30 d后上升，至60 d后再下降的趋势。试验组血清中SOD活性除 60 d 外，其他投喂时间均大于对照组。试验组血清中的CAT活性除30 d和120 d外，其他处理均显著高于对照组(P<0.05)。从60 d起，试验组血清中SOD活性随太子参提取液浓度的增加呈上升趋势。在30 d时，C1.0试验组血清中SOD活性达到最高，为(343.74±0.13) U/mg；30 d时，血清中LZM活性达到最高的为C0.5组，为(7.35±0.02) U/mL；饲喂15 d时，C1.5组血清中CAT活性达到最高值，为(5.75±0.02) U/mL。

2.3 添加太子参提取液对大黄鱼吞噬细胞吞噬功能的影响

饲养60 d，试验组的吞噬百分率与对照组差异不显著(P>0.05)，仅C0.5试验组吞噬百分率略高于对照组，C1.0组的吞噬百分率在前60 d均不如对照组高，而60 d后，该组的吞噬百分率显著高于对照组(P<0.05)；养殖至120 d，各添加太子参提取液试验组的吞噬百分率均显著高于对照组(P<0.05)，C1.0组的吞噬百分率达到最高，为(63.3±0.03)%(图3-A)。

饲养15 d，试验组的吞噬指数均低于对照组；养殖至30 d，C0.5、C1.5和C2.0组的吞噬指数高于对照组，C1.0组的吞噬指数略低于对照组，但差异不显著(P>0.05)；饲喂60 d，仅C0.5和C2.0组吞噬指数高于对照组；饲喂120 d，添加太子参提取液的各试验组的吞噬指数均显著高于对照组(P<0.05)，C1.0组的吞噬指数达到最大值，为2.70±0.10(图3-B)。

3 讨论与结论

3.1 太子参提取液对大黄鱼血清免疫球蛋白含量的影响分析

免疫球蛋白是由淋巴细胞所制造产生的，是鱼类的初级特异性免疫系统中的一个重要成分，在鱼类特异性免疫过程中发挥了重要作用，可用于鱼类抵抗疾病，防御病害。Siwicki等首次利用血清中的免疫球蛋白含量来评价鱼类的免疫功能[27]；Adham等以血清蛋白、白蛋白和免疫球蛋白的含量变化作为检测环境对鱼类健康影响的免疫指标；在机体免疫过程中，免疫球蛋白起重要保护作用，能够抵抗病菌、抵御病毒，促进鱼体有效地预防相应的感染性疾病[28]。在本试验中，添加太子参提取液对于大黄鱼的血清免疫球蛋白含量具有一定的提高作用，表现为添加太子参提取液的各试验组饲喂60 d及之前均高于对照组，但饲喂120 d后，各试验组免疫球蛋白含量趋于稳定，且均低于对照组。这与杨启莲等的试验结果表明免疫球蛋白含量会在机体感病后的一段时间才会出现熟知的显著变化[29]相符。

3.2 太子参提取液对大黄鱼血清免疫酶活性的影响分析

LZM是生物体重要的非特异性免疫因子之一，具有杀菌、抗感染、诱导调节其他免疫因子合成和分泌、增加免疫力、修复伤口等功能[31，41]。本次在试验前期，C0.5和C2.0组LZM活性显著升高，这一结果与盛竹梅等采用五倍子为主要配方的复方中药也可显著提高鲫鱼(Carassiusauratus)血清溶菌酶的活性研究结果[42]一致。同时还发现饲喂120 d，各试验组溶菌酶活性均低于对照组，结果与石和荣等研究中发现的随中草药含量升高，酶活性降低的结论[43]相符。

过氧化氢体为不常见的细胞器，存在于机体内的红细胞及某些组织中，过氧化氢体的主要特点是储存着CAT，该酶是生物防御体系的关键酶之一，主要作用是催化清除体内多余的过氧化氢，使细胞免于遭受H2O2的毒害[44]。本试验采用太子参饲喂大黄鱼15 d时，添加量为0.5%、1.0%及1.5%组的CAT活性显著升高。这与李梅芳等投喂大黄、党参和五倍子等6种中草药显著提高了大黄鱼的血清CAT活性，增强了非特异性免疫活性结果[31]一致。

3.3 太子参提取液对大黄鱼吞噬细胞的吞噬功能影响分析

鱼类特异性免疫能力较弱，主要依靠非特异性免疫系统，白细胞的吞噬活性又是鱼类非特异性免疫的重要组成部分[45-47]。试验期间，各添加太子参提取液的试验组白细胞吞噬活性随时间推移总体呈上升趋势，经 120 d 的饲养，试验组吞噬活性均高于对照组，说明太子参提取液具有提高大黄鱼吞噬功能的功效。在试验过程中发现，试验组和对照组大黄鱼均出现了感染的白点内脏，这可能导致吞噬活性增强[48]。

3.4 太子参提取液作为大黄鱼饲料添加剂的可行性分析

近些年，大黄鱼产业发展飞快，养殖户为追求产量和利润，不断扩大养殖规模，养殖密度逐渐增加致使对养殖海区水体的破坏日益严重，恶化的养殖环境导致大黄鱼因感染寄生虫，继而感染继发性细菌病大量致死现象出现。目前在大黄鱼人工配合饲料的开发和应用方面，水平仍较低[49-51]。本次研究表明，添加太子参提取液有利于提高大黄鱼的非特异性免疫。同时太子参具有毒副作用小、无药物残留等优点，兼有营养性和药物性的双重作用，能促进鱼类机体免疫反应，提高其抗逆性。本试验进一步表明，饲料中添加0.5%～1.5%太子参提取液(浓度40 mg/L)可提高大黄鱼血清LZM、SOD、CAT的活性，IgG含量及吞噬功能，增强大黄鱼的非特异性免疫机能，具有减少病害发生的可能，从而保证大黄鱼的品质安全。