实时荧光定量技术在食品微生物检测和研究中的应用

王春梅

（山东省东营市广饶县疾病预防控制中心，山东广饶 257300）

实时荧光定量技术作为一种成熟的微生物检测方法，在实践应用过程中表现出极强的精准度与灵敏性，是现阶段食品安全管理的重要举措[1]。为更好地发挥其技术优势，规避实时荧光定量技术的应用误区，有必要从实践角度出发，坚持需求导向、目标导向以及结果导向，立足荧光定量技术原理，在总结过往技术应用经验前提下，立足于食品微生物检测要求，划定检测框架，厘清检测流程，确保实时荧光定量技术应用的标准化与规范化，切实满足现阶段食品微生物检测要求，强化食品安全风险管控能力，加速形成良好的市场秩序。

1 实时荧光定量技术概述

本文全面梳理实时荧光定量技术原理以及技术特点，实现技术观念全面改变，明确技术应用场景，掌握技术应用重点，为实时荧光定量技术在食品微生物检测中的科学、高效应用提供方向性引导。

1.1 实时荧光定量技术原理

实时荧光定量技术主要通过扩增反应，对每个循环产物中的荧光信号进行检测，通过对起始模板开展定量以及定性分析，确保检测数据的有效性与合理性[2]。实时荧光定量技术在荧光化学物质的有效介入下，可以确保反应产物不断积累，加速检测进程，缩短检测周期。在整个反应产物积累过程中，荧光信号强度也出现持续变化，对每轮荧光强度信号开展强度监测，可以快速获取信号变化规律，在此基础上，绘制荧光扩增曲线图，检测人员可通过荧光扩增曲线开展深入分析，可以在较短时间内，快速完成检验分析任务，获取目的基因初始量，实现对检测对象的精准识别。实时荧光定量技术在长期实践过程中，技术类型逐步多元化，通过技术模块的合理化选择，满足不同场景下的食品微生物检测要求。从技术原理以及应用效果来看，实时荧光定量技术具有技术成熟，操作环节简单，成本投入较低以及较强可行性的特点。

1.2 实时荧光定量技术优势

实时荧光定量技术具有反应速度快、灵敏性高、特异性强等优势，可满足食品检测工作的要求，有效兼顾了检测精准度与实效性要求，通过实时荧光定量技术的合理化应用，可提升食品微生物检测能力，推动食品安全管理的健全与完善[3]。实时荧光定量技术从本质上来看，属于封闭性反应体系，反应条件较为简单，检测工作推进过程中，不需要电泳、染色等步骤，因此检测流程得以简化，客观上缩短了食品微生物检测周期，提升了检测效率。同时实时荧光定量技术使用全新的升降温机制，可灵敏地管控温度，大大减少了扩增反应周期，将整个检测周期控制在2 h内。与常规荧光定量技术相比，实时荧光定量技术数据获取难度较低，增强了检测数据的可靠性与精准性，为后续食品安全风险评估提供了依据[4]。实时荧光定量技术依托光谱技术与计算机技术，实现了检测灵敏度的有效提升。在实际应用环节，实时荧光定量技术对于DNA检测浓度可以到pg级别，最大程度地保证检测效果，排除干扰因素影响。实时荧光定量技术在微生物检测过程中，增加了荧光探针，这种检测方案主要针对于靶序列，可以确保非特异性产物无法与探针进行杂交，有效分离与特异性物质分子量接近的物质，实现特异性精准划分，确保食品微生物检测任务的顺利完成[5]。基于实时荧光定量技术优势，越来越多的检测团队尝试转换思路，着眼检测要求，采取必要举措，推动实时荧光定量技术在食品微生物检测中的科学、高效应用，确保检测的有效性与精准性。

2 实时荧光定量技术在食品微生物检测中的应用

实时荧光定量技术在食品微生物检测中的应用，要求检测团队立足于检测原理，以科学性、实用性原则为框架，采取系列举措，确保实时荧光定量技术的合理化应用，全面满足食品微生物检测要求。

2.1 实时荧光定量技术在食品致病菌检测中的应用

实时荧光定量技术在食品致病菌检测过程中，检测人员需从实践角度出发，认真做好检测流程理顺、检测方法优化等系列工作，确保实时荧光定量技术优势的全面发挥，实现对致病菌的精准识别[6]。考虑实际检测要求，检测人员需要合理优化检测环节，科学做好探针、染色等检测步骤的优化调整，以更好地提升检测的有效性。基于实时荧光定量技术特性，为排除扩增效率、试剂损耗等因素影响，在数据计算过程中，检测人员可以充分利用Q值，借助扩增指数增长情况，确立起始模板，以此为标准，便于开展检测过程中的数据对比。以金黄色葡萄球菌检测为例，在使用实时荧光检测过程中，在做好样本制备的基础上，利用技术优势，技术人员可以采用TaqMan探针和SYBR Green染料两种方法，快速定量检测金黄色葡萄球菌，同时对于检测数据，使用数据处理软件，开展检测数据分析，进而获得黄金葡萄球菌浓度。这种方法对目前已知的29株临床和食源性金黄色葡萄球菌egc变种菌株、4株egc阴性金黄色葡萄球菌菌株和37株种族近似的相关菌株的检测特异性都接近100%，在实践过程中，表现出较强的实用属性[7]。

2.2 实时荧光定量技术在食品基因检测中的应用

现阶段，为了保证食品微生物检测的精准度，在实时荧光定量技术应用环节，检测人员可以有序开展食品基因检测等工作，通过基因序列识别，提升检测技术的应用水平[8]。与传统基因检测方法相比，实时荧光定量技术实用性与可操作性较强，可快速完成检测任务，有效满足现阶段食品基因检测要求，对于食品生产、加工等系列活动开展提供了技术支撑。在转基因成本定量分析中通常选择转基因生物基因组中的外源序列作为目标序列，其中包括启动子、终止子、目的基因等。根据检测的外源目标序列的不同分类，转基因食品在应用实时荧光定量检测技术进行检测时，技术人员集中进行通用序列检测、结构特异性序列检测、基因特异性序列检测，通过全方位检测，判定基因序列，从而顺利完成基因检测任务，快速掌握基因信息。

3 实时荧光定量技术应用注意事项

3.1 科学设定检测标准

实时荧光定量技术在应用过程中，为确保检测成效以及检测结果的精准性，有必要从检测技术原理出发，定向做好检测样本比较工作。基于实时荧光定量技术，在实际检测环节，应设定实时荧光定量反应指数，预先框定荧光信号域值，当检测数据超过荧光信号域值时，可以将其认定为真正的检测信号，在此基础上，开展数据监测，科学定义样本预值循环数，从而达到定量分析的目的。根据相关研究，设定的实时荧光信号域值与检测对象起始拷贝的对数存在较为明显的线性关系，起始检测对象拷贝数量越多，域值越小，基于这种内在逻辑联系，在检测过程中，可以根据已知的各类数据绘制标准曲线，将其作为评估未知样品检测域值的重要依据，实现对未知成分属性的科学评估[9]。

3.2 实现无误差的科学处置

实时荧光定量技术在应用过程中，在部分条件下会受到同源DNA、异源DNA、寡核苷酸杂交特异性、探针比例和细胞分解效率等因素的影响，造成定量检测结果出现偏差，甚至出现假阳性情况[7]。为排除干扰因素的影响，检测人可借助有效的数据处理，通过数学模型，缩小误差，确保检测结果的精准度。检测人员需通过标准曲线的绘制，借助相关软件，设置异常数据报警提醒，从而消除数据误差，提升整个检测工作的精准度。同时积极探索实时荧光定量技术样品制备的简单化、快捷化方式，逐步提升检测成效，缩短样本制备周期，推动整个检测流程的有序开展。

3.3 全面提升数据分析能力

实时荧光定量技术应用过程中会产生大量数据，需要检测人员根据实际需要开展定性与定量研究，通过数据发掘，排除干扰因素，确定食品中的微生物含量，顺利完成食品检测任务。基于提升数据分析能力的考量，检测人员可吸收、借鉴以往经验，利用大数据技术、专业数据处理软件对实时荧光定量检测环节产生的扩容数据等开展综合分析，快速绘制标准曲线，通过检测数据与标准数据的横向对比，准确判定检测结果。同时，开展数据分析能力培训与提升专项活动，定期组织人员开展系列学习活动，介绍实时荧光定量检测数据分析新方法、新路径，逐步提升检测人员对于检测结果的分析能力。

4 结语

食品产业发展过程中，为提升安全水平，化解潜在风险，应做好微生物检测工作，实现食品安全的有效管理。实时荧光定量技术凭借自身优势，能够较好地满足食品微生物的检测要求，实现食品安全的有效管理，减少公共卫生事件的发生机率。本文着眼于实际，在明确实时荧光定量技术原理以及技术优势基础上，梳理技术应用新思路，摸索技术应用新方法，实现实时荧光定量技术的高效化使用，构建现代化食品微生物检测技术体系。