重组人脑利钠肽对慢性心衰大鼠免疫和FAK、Bax、Bcl-2、p53的影响及相关性分析

刘培君 康秀峰雷晓亭洪志斌（天水市第一人民医院心内科，天水 741000）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由多种原因引起的心肌损伤，导致患者充盈功能低下，发病早期症状不明显，临床多表现为乏力、呼吸困难及体液潴留等。近年来，CHF的发生率呈上升趋势，且五年存活率与恶性肿瘤相近，影响患者健康生活［1-2］。既往研究表明，CHF的发生、发展常伴有心肌细胞凋亡，呋塞米属于临床常用药物，虽然能延缓病情发展，但远期预后较差，不良反应发生率较高，导致临床使用受限［3］。重组人脑利钠肽属于人体分泌的一种内源性多肽，重组DNA技术利用大肠杆菌冻干制剂能与心室肌产生的内源性脑利钠肽具有相同的氨基酸序列［4-5］。同时，药物能拮抗心肌细胞、心纤维原细胞、血管平滑肌细胞内皮素，有助于提高肾小球滤过率，促进钠的排泄［6］。因此，本研究以SD大鼠为研究对象，探讨重组人脑利钠肽在慢性心衰大鼠中的作用机制及对黏着斑激酶（FAK）、Bcl-2相关C蛋白（Bax）、心肌组织凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）及抑癌基因p53（p53）的影响报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物健康清洁级SD大鼠40只，雌雄随机，体质量220～280 g，平均（250.00±20.00）g，随机取10只设为空白对照组；剩余30只复制大鼠CHF动物模型，建模成功后随机分为模型对照组、呋塞米组和重组人脑利钠肽组，10只/组。动物合格证号：SCXX-2005-0001，所选动物均购于实验动物房，完成大鼠的常规喂养、光照。

1.1.2 主要试剂与仪器注射用苯巴比妥钠（上海新亚药业有限公司）；盐酸多柔比星，规格：10 mg/支（山西普德药业股份有限公司）；ELISA试剂盒（美国R&D Systems公司）；BCA蛋白定量试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；冻干重组人脑利钠肽，规格：0.5 mg×1瓶/盒（成都诺迪康生物制药有限公司）；内参抗体β-actin（美国Sigma公司）；大鼠饲养笼（西安交通大学动物实验中心）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；小动物超声仪，型号Vevo770型（Visuslsonics公司）；台式高速低温离心机（德国Herolab公司）。

1.2 方法

1.2.1 建模与分组

1.2.1.1 建模剩余30只大鼠采用盐酸多柔比星隔日腹腔注射法复制大鼠CHF动物模型，具体方法如下：给药剂量依次为第1、3天剂量为1 mg/kg、第5、7天剂量为2 mg/kg、第9、11天剂量为3 mg/kg、第13、15天剂量为4 mg/kg，连续完成8次给药，累计剂量为20 mg/kg。上述操作完毕后对大鼠连续完成3周喂养，并完成其生命体征监测。左心室质量/体质量为左心室质量指数（LVMI），右心室质量/体质量为右心室质量指数（RVMI），左心室肌HE染色，并配合大鼠的行为、体征判断造模标准［7-8］。

1.2.1.2 分组建模成功后随机分为模型对照组、呋塞米组和重组人脑利钠肽组，10只/组。处理方法：空白对照组与模型对照组给予等剂量生理盐水；呋塞米组采用呋塞米溶液［10 mg/（kg·d）］灌胃干预，重组人脑利钠肽组采用重组人脑利钠肽溶液［15μg/（kg·d）］皮下注射4周。

1.2.2 观察指标

1.2.2.1 心功能水平采用超声心动图检测大鼠心功能水平，包括左室舒张期内径（LVIDd）、左室收缩期内径（LVIDs）、射血分数（EF）及短轴缩短分数（FS）水平的测定［9］。

1.2.2.2 免疫水平4组大鼠干预后4周以断颈方式处死，取颈动脉血3 ml，流式细胞仪完成CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的水平测定［10-11］。

1.2.2.3 FAK、Bax、Bcl-2及p53水平4组大鼠处理4周后以断颈方式处死，取心肌组织100 mg，向组织中加入1 ml裂解液完成组织裂解，12 000 r/min离心15 min。取上清，根据BCA法完成相关蛋白浓度测定；沸水浴变性，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后加入5%脱脂牛奶封闭，分别加入FAK、Bax、Bcl-2及p53蛋白一抗，孵育过夜后加入二抗，并以化学发光法显色，胶片曝光后显影［12-13］。

1.3 统计学分析采用SPSS18.0软件处理，计量资料行t检验，采用±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心功能比较重组人脑利钠肽组和呋塞米组心功能LVIDd、LVIDs水平低于模型对照组（P＜0.05）；EF及FS水平高于模型对照组（P＜0.05）；重组人脑利钠肽组干预4周后LVIDd、LVIDs水平低于呋塞米组（P＜0.05）；EF及FS水平高于呋塞米组（P＜0.05），见表1。

表1 4组心功能比较（±s）Tab.1 Comparison of cardiac function among four groups（±s）

表1 4组心功能比较（±s）Tab.1 Comparison of cardiac function among four groups（±s）

Note：Compared with blank control group，1）P＜0.05；compared with model control group，2）P＜0.05；compared with furosemide group，3）P＜0.05.

Groups Recombinant human brain natriuretic peptide Furosemide Model control Blank control n 10 10 10 10 LVIDd/mm 9.59±1.781）2）3）10.73±2.111）2）11.21±2.151）8.48±0.62 LVIDs/mm 6.84±1.591）2）3）8.43±2.061）2）10.26±2.611）5.31±0.84 EF（%）54.39±4.741）2）3）43.34±3.791）2）22.49±2.131）64.59±5.62 FS（%）30.32±3.891）2）3）21.59±3.381）2）10.49±2.421）35.63±4.30

2.2 各组免疫水平比较重组人脑利钠肽组和呋塞米组CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平高于模型对照组（P＜0.05）；CD8+水平低于模型对照组（P＜0.05）；重组人脑利钠肽组干预4周后CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平高于呋塞米组（P＜0.05）；CD8+水平低于呋塞米组（P＜0.05），见表2。

表2 4组免疫水平比较（±s，%）Tab.2 Comparison of immune levels among four groups（±s，%）

表2 4组免疫水平比较（±s，%）Tab.2 Comparison of immune levels among four groups（±s，%）

Note：Compared with blank control group，1）P＜0.05；compared with model control group，2）P＜0.05；compared with furosemide group，3）P＜0.05.

Groups Recombinant human brain natriuretic peptide Furosemide Model control Blank control n 10 10 10 10 CD3+58.43±4.311）2）3）49.68±3.691）2）45.71±2.491）63.29±4.59 CD4+42.14±3.111）2）3）37.39±3.171）2）34.21±2.491）46.49±3.23 CD8+29.53±4.521）2）3）32.23±4.391）2）35.45±5.791）27.29±3.23 CD4+/CD8+1.43±0.231）2）3）1.16±0.161）2）0.97±0.111）1.70±0.27

图2 各组FAK、Bax、Bcl-2及p53蛋白表达量Fig.2 Expressions of FAK，Bax，Bcl-2 and p53 protein in each groups

2.3 各组FAK、Bax、Bcl-2及p53水平比较BCA法测定结果表明，重组人脑利钠肽组和呋塞米组FAK、Bax、p53水平低于模型组（P＜0.05）；Bcl-2水平高于模型组（P＜0.05）；重组人脑利钠肽组FAK、Bax、p53水平低于呋塞米组（P＜0.05）；Bcl-2水平高于呋塞米组（P＜0.05），见图1、2。

图1 4组FAK、Bax、Bcl-2及p53相对表达量比较Fig.1 Comparison of relative expressions of FAK，Bax，Bcl-2 and p53 in four groups

3 讨论

目前，临床上对于CHF的发病机制尚未阐明，而心肌细胞凋亡在疾病的发生、发展中发挥重要作用［14］。既往研究表明，心肌细胞凋亡是引起心功能不全的重要原因，在整个疾病中发挥重要作用，且心力衰竭越严重，心肌细胞凋亡数越多［15］。利钠肽属于心力衰竭患者体内最为重要的神经内分泌激素之一，而重组人脑利钠肽的使用可作为人体应激大量产生的补充代偿机制［16］。本研究中，重组人脑利钠肽组干预后4周LVIDd、LVIDs水平低于呋塞米组；EF及FS水平高于呋塞米组，提示重组人脑利钠肽的干预可改善大鼠心功能水平，利于大鼠恢复。重组人脑利钠肽可通过降低动脉与静脉压力，增加心输出量，抑制神经激素激活水平，从而影响机体血流动力学。由于重组人脑利钠肽对于机体的作用决定了其激动剂在临床上的应用及发作，其广泛应用于心力衰竭的治疗［13］。现代药理结果表明，重组人脑利钠肽是利用DNA技术合成的生物制剂，并以大肠杆菌为生成菌种，具有较高的纯度，且与内源性BNP具有相同的生物活性［17］。同时，重组人脑利钠肽亦可发挥中度利尿作用，能增加肾小球系膜细胞含量，扩张肾脏入球的小动脉，有助于提高肾脏肾小球滤过率，改善机体免疫水平。本研究中，重组人脑利钠肽组干预4周后CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平高于呋塞米组；CD8+水平低于呋塞米组，提示重组人脑利钠肽可改善CHF大鼠免疫水平，提高机体的抗病能力，减轻肾脏组织损伤，利于大鼠恢复。

现代药理结果表明，FAK是胞内外信号出入的中枢，可介导多条信号通路，整合源于整合素、生长因子及机械刺激的信号，参与细胞的生长、调节，在CHF的发生、发展中发挥重要作用；Bcl-2是癌基因的一种，具有抑制细胞凋亡作用，能抑制由多种细胞毒因素引起的细胞凋亡。既往研究表明，Bcl-2能增强细胞对多数DNA损伤因子发挥良好的抵抗性，但难以促进DNA修复［18］。而p53蛋白属于DNA损伤的分子传感器，Bcl-2能抑制p53介导的凋亡，参与CHF的发生。Bax属于兔抗人单克隆抗体，过度表达的Bax会对Bcl-2产生影响，加速细胞凋亡［19］。本研究中，重组人脑利钠肽组FAK、Bax、p53水平低于呋塞米组；Bcl-2水平高于呋塞米组，提示重组人脑利钠肽可改善FAK、Bax、p53、Bcl-2水平，为CHF的治疗提供新的思路和方法。既往研究表明，CHF的发生、发展是一个多因素过程，常伴有免疫水平异常，能引起T淋巴细胞水平异常。通过比较CHF与非CHF患者FAK、Bax、p53、Bcl-2水平发现，T淋巴细胞与FAK、Bax、p53、Bcl-2表达水平存在紧密联系，加强FAK、Bax、p53、Bcl-2水平测定可反映、评估机体免疫状态，指导临床治疗。

综上所述，重组人脑利钠肽用于CHF大鼠中有助于提高其心功能水平，改善机体免疫水平，降低FAK、Bax、p53水平，提高Bcl-2水平，可为慢性心衰治疗提供参考依据。