利妥昔单抗治疗儿童原发性肾病综合征机制的研究进展

姚超 段培锋

滨州医学院附属医院儿童消化与肾病科，滨州 256600

原发性肾病综合征（primary nephrotic syndrome，PNS）是儿童常见的肾脏疾病，以大量蛋白尿、低蛋白血症和/或水肿为临床特征［1-2］，16岁以下儿童发病率为（1～3）/10万［3］。其主要病理表现为微小病变型肾病（MCGN）和局灶节段性肾小球硬化（FSGS）。90%的PNS对糖皮质激素敏感，使用泼尼松2 mg/kg治疗4周后，尿蛋白即可转阴，称为激素敏感型肾病综合征（SSNS）。10%的PNS对糖皮质激素治疗无效，称为激素抵抗型肾病综合征（SRNS），同时50%～60%的SSNS表现为激素依赖或频繁复发，称为激素依赖型肾病综合征（SDNS）或频复发型肾病综合征（FRNS）。为避免长期使用糖皮质激素引起的骨质疏松、肥胖、垂体抑制等不良反应［4］。RNS患儿常用环磷酰胺、霉酚酸酯、他克莫司/环孢素等免疫抑制剂进行治疗。然而即使糖皮质激素联合免疫抑制剂，仍有20%左右NS表现为复发或者依赖，且长期使用免疫抑制剂具有严重的肾脏毒性［4］，因此，迫切需要一种新的更加安全有效的药物。

利妥昔单抗（rituximab，RTX）是一种针对CD20的单克隆抗体，最早用于治疗成人复发的CD20阳性低级别淋巴瘤，近十年来，因其在治疗儿童复杂肾病综合征上的良好效果而备受关注［5］。近年关于其有效性和安全性的研究表明，相较于免疫抑制剂，RTX能显著降低NS患者的蛋白尿水平，有效延长持续缓解时间，降低复发率［6］，且不良反应相对较轻，亦不具有肾脏毒性［7］，因此，在NS治疗领域，RTX是一种极具潜力的新型药物。但目前对RTX治疗PNS的研究多集中在其有效性和安全性上，对其缓解蛋白尿的具体机制研究较少。现对近年来RTX缓解蛋白尿的机制研究进行总结，以期为RTX治疗PNS的临床实践及研究提供参考。

RTX通过与鞘磷脂磷酸二酯酶类酸3b（SMPDL-3b）结合阻止足细胞损伤

研究表明足细胞的损伤是导致蛋白尿的重要原因，而足细胞结构和功能的完整性对维持肾小球滤过屏障有着重要的作用［8］。足细胞复杂的三维形态依靠肌动蛋白相关的细胞骨架维持，细胞骨架的崩解是造成足细胞损伤的重要原因［9］。Palladin是一种与肌动蛋白有关的蛋白，在维持细胞骨架稳定性上起着重要作用［10］。Artelt等［10］研究发现，与对照组相比，特异性敲除足细胞palladin的小鼠出现了肾小球形态紊乱，足细胞间隙增大，轻度凋亡。有学者发现，糖尿病肾病和FSGS患者的肾活检标本也显示足细胞中Palladin的下调。这些研究表明，正常的细胞骨架结构对维持足细胞的功能有着重要作用。

SMPDL-3b是一种将鞘磷脂转化为神经酰胺的脂质修饰酶，在巨噬细胞、树突状细胞和足细胞上显著表达［11］。SMPDL-3b通过负性调节toll样受体参与细胞信号转导、足细胞骨架调节及固有免疫的负性调节［12］。SMPDL-3b已被报道参与足细胞细胞骨架的调节。Ahmad等［13］发现辐射能诱导足细胞骨架重塑，但高表达SMPDL-3b的足细胞能在辐射下保持细胞骨架的稳定，同时SMPDL-3b的下调使足细胞更容易发生肌动蛋白的重塑。

Fornoni等［14］对12例未复发的FSGS患者和8例复发的FSGS患者进行肾脏活检分析，发现复发型FSGS患者SMPDL-3b+足细胞的数量低于非复发型FSGS。同时用正常人的血清和反复复发的FSGS患者血清分别体外培养足细胞，发现与正常人血清培养的足细胞相比，反复复发的FSGS患者血清培养的足细胞其SMPDL-3b mRNA明显下调。这表明SMPDL-3b在反复复发的FSGS患者中表达下降。但RTX可以阻止足细胞中SMPDL-3b的下调。Takahashi等［15］分别用RTX（10 mg/kg）和提纯的人免疫球蛋白（Ig）G治疗阿奇霉素诱导的肾病大鼠，每周1次，分别于第1、5、7、14、28天采集尿液标本，用免疫荧光染色和聚合酶链式反应（RT-PCR）检测蛋白尿、SMPDL-3b和足细胞相关蛋白的表达。免疫荧光显示，在第28天时，用RTX治疗的大鼠其SMPDL-3b及SMPDL-3 bmRNA的表达明显高于人IgG处理组（P＜0.001），高于正常组（P＜0.01）。此外，用RTX处理正常大鼠，注射RTX 24 h后，SMPDL-3b mRNA的表达明显增高（P＜0.01）。这些结果表明，RTX能通过与SMPDL-3b的结合，阻止SMPDL-3b在足细胞内的下调，从而稳定足细胞肌动蛋白细胞骨架，避免足细胞损伤，缓解蛋白尿。

但部分学者对于RTX是否与SMPDL-3b特异性结合仍有质疑。Kim等［16］用RTX和抗透明质酸（HA）标记抗体孵育非固定细胞，在表达HA-SMPDL-3b的293T细胞中，可用HA抗体进行染色，但不能用RTX进行染色。并且当细胞在抗体染色前用多聚甲醛固定时，Kim等［16］观察到RTX与细胞的结合与SMPDL-3b的表达无关。在过表达HA-SMPDL-3b的HeLa细胞中也得到了类似的结果。这些结果表明，RTX在体内可能不与SMPDL-3b结合，RTX对肾病的疗效可能并不是通过与SMPDL-3b结合直接调节足细胞来实现的。

RTX通过耗竭B细胞参与蛋白尿的缓解

B细胞作为一种免疫细胞参与NS的发病。Dossier等［17］发现特发性肾病综合征（INS）患者外周血总B细胞计数在缓解期明显减少。Colucci等［18］对INS患儿在使用糖皮质激素治疗前进行采血，发现较对照组而言，INS患儿的B细胞明显增多。Kidoguchi等［19］也曾报道过1例由弥漫性大B细胞瘤继发膜性肾病的病例。这些证据表明，B细胞可能在NS的发展中起着重要作用。

CD20抗原是一种高表达于前期至晚期B淋巴细胞上的磷酸化蛋白，在B细胞分化为浆细胞后消失。CD20通过调节跨膜钙离子流，对B细胞的增殖和分化起着重要的调节作用［20］。RTX作为一种人鼠嵌合单克隆抗体，其鼠源区Fab段能特异性和CD20结合，通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用、补体依赖的细胞毒作用以及启动Caspase-3介导的信号转导通路诱导细胞凋亡等机制清除B细胞［21］。

1、RTX减少炎症因子的分泌

B细胞源性细胞因子是NS发病的重要原因。B细胞激活后会分泌各种细胞因子，包括干扰素-γ、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-4、IL-10、IL-13等［22］，这些细胞因子介导足细胞的免疫损伤。Kim等［16］在小鼠实验中证实IL-4、IL-13通过激活酪氨酸激酶JAK1和JAK3，启动转录因子STAT6，促进肌动蛋白骨架的形成，诱导足细胞褶皱、足突消失。McDonald等［23］研究发现RTX可以降低特异性湿疹患者血清中IL-13的水平。Ma等［24］将野生型雄性C57BL/6J小鼠采用腹横主动脉缩窄法进行压力负载，然后静脉注射RTX 4周，用实时荧光定量PCR分析心脏组织中IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA水平（6例）。免疫印迹显示，与对照组相比，RTX显著降低促炎细胞因子mRNA和蛋白质的表达，同时细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、STAT3、转 化 生 长 因 子β（TGFβ）/Smad2/3和IKKα/β/核 转 录 因子-κB（NF-κb）等多种信号通路显著减少。这表明RTX阻断了CD20介导的B细胞激活，从而抑制IKK/NF-κb信号通路介导的促炎因子的释放，阻止炎症因子对足细胞的损伤。

2、RTX抑制抗体的分泌

B细胞分化为浆细胞后分泌的抗体也参与NS的发病，RTX能间接抑制抗体的分泌。在部分肾病患儿体内观察到Ig水平出现明显改变，表现为急性期IgG明显降低及IgE明显升高。Jamin等［25］亦观察到部分INS患者外周血抗泛素羧基末端水解酶-1（UCHL-1）抗体明显升高，而健康对照组则未曾检测到此抗体。正常小鼠注入UCHL-1抗体可以诱导足突广泛融合并产生大量蛋白尿，提示该抗体可能参与了部分INS患者的发病。Ma等［24］用酶联免疫吸附试验法分析腹横主动脉缩窄诱发心肌重构患者体内的Ig水平，发现RTX处理组的IgG水平较对照组明显下降，提示RTX可能降低B细胞分泌抗体的水平。分泌抗体的浆细胞表面并不表达CD20，故RTX并不直接抑制浆细胞抗体分泌。目前多数学者认为Th2型细胞因子如IL-4、IL-5和IL-10等能刺激B细胞产生抗体，而RTX能阻断CD20介导的B细胞活化，从而减少Th2型细胞因子的产生，间接导致抗体水平的降低［24］。

RTX通过调节T细胞亚群缓解蛋白尿

一直以来，T细胞就被认为是造成足细胞损伤的主要免疫细胞。早在40多年前，Shalhoub［26］认为MCGN是由功能失调T细胞产生的循环因子诱导的。近年来研究表明，T细胞是足突消失和诱发蛋白尿的主要效应细胞。T细胞亚群失衡及调节性T细胞（Treg）数量和功能的下降在蛋白尿的发生发展过程中起着重要作用［27］。

Th1/Th2的平衡对维持机体正常的免疫功能至关重要，Th1/Th2失衡与自身免疫性疾病、过敏性疾病、肿瘤和移植排斥反应等的发生和发展有着密切关系［28］。Kanai等［29］用配对样本来测量SSNS患者中Th1/Th2比率和Th1和Th2分泌的细胞因子水平，发现在SSNS活动期Th1细胞明显降低，Th2细胞及其产生的细胞因子IL-5明显升高，Th1/Th2比值下降，而在缓解期，Th1和Th2的水平趋于正常。这提示INS的发病与Th1/Th2比例失衡造成的T细胞免疫功能紊乱存在着密切关系。近些年有研究表明RTX可以重塑Th1和Th2的亚群比例。Bhatia等［28］进行一项前瞻性研究，他们采集了18例SDNS患者在RTX治疗前、1个月、1年后及首次复发时的血液和尿液样本，并用流式细胞术检测样本中T淋巴细胞及其亚群的数量和比例，发现在RTX治疗后Th2细胞计数下降（P=0.004 1），而Th1计数无显著差异；在复发患者中，Th2细胞计数增加（P=0.007 8）。与对照组相比，患者的Th1/Th2比值更低［患者基线：7.7（3.2～13.2）比对照组15.9（10.5～20.4）；P=0.001 8］，RTX治疗1个月后，这一比例增至14.0（6.6～24.5）（P=0.010 2），但在复发期，Th1/Th2比值又明显下降。这些结果表明RTX可以降低Th2细胞的绝对数量，从而上调Th1/Th2的细胞亚群比例，改善T细胞亚群失衡引起的免疫紊乱状态。

Treg功能紊乱及辅助性T细胞17（Th17）/Treg比例失衡是INS发生发展的另一个重要原因。Chan等［30］发现INS患儿Treg增多时，蛋白尿明显减少。Li等［31］发现INS儿童外周血单核细胞中Th17细胞增多，Treg数目减少。Th17能促进足细胞发生凋亡［32］，但其导致蛋白尿的机制尚不十分清楚，Wang等［32］认为可能和Th17诱导足细胞骨架蛋白稳定性下降有关，而Treg可以阻止这一过程。最近的研究表明，RTX可以增加Treg数量并恢复其调节功能。Garin等［33］曾用流式细胞术检测接受RTX治疗的慢性特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者的Treg，发现与对照组相比，ITP患者的Treg数量减少，抑制能力缺陷，但在使用RTX治疗后，Treg的数量及调节功能均明显恢复。也有报道指出，活动性膜性肾病患者在使用RTX获得临床缓解后，Treg比基线增加了10倍［34］。Bhatia等［28］的前瞻性试验显示，与对照组相比，SDNS患者在RTX治疗1月后，Th17细胞的中位数比例由1.3降至0.7（P=0.025），Th17的绝对值计数也随之下降，患者的Treg比值随之上升（P=0.000 2）。这些研究结果表明RTX可以影响T细胞的分化，下调Th17的表达，上调Treg的数量及活性，通过重置Th17/Treg比例改善紊乱的T细胞免疫，从而达到蛋白尿的缓解。

目前关于RTX如何影响Treg和Th17的具体机制尚不十分清楚，可能和其B细胞耗竭有关。Chan［30］推测RTX可能是通过耗竭B细胞及其细胞因子IL-6和TGFβ来调节Th17的分化。有研究表明RTX可以降低类风湿关节炎患者的局部Th17反应，但在B细胞缺失的情况下，RTX对Th17的抑制效应消失，提示B细胞在Th17反应的发展中起到了重要作用，为RTX通过耗竭B细胞来抑制Th17反应提供了证据［35］。Ciccia等［36］则认为RTX通过诱导肥大细胞的凋亡来抑制Th17的分化和IL-17的释放。Eggleton和Bremer［37］则在类风湿关节炎患者中发现部分产生IL-17的CD3+CD4-CD8-T细胞（“双阴性”T细胞）和CD4+Th17在细胞表面共表达CD20。Holley等［38］亦在多发性硬化患者的血液和大脑中发现CD20+Th17细胞。这表明，部分T细胞可以直接表达CD20，而RTX可以通过和T细胞表面的CD20分子特异性结合，诱导Th17细胞的直接耗竭。但具体相关机制仍有待进一步研究。

结语与展望

INS是儿童常见的肾脏疾病，RTX治疗INS，尤其是难治性肾病综合征的有效性和安全性越来越受到肯定。RTX一方面通过非免疫调节作用，稳定足细胞的细胞骨架，避免足细胞的崩解，另一方面通过调控免疫细胞数量及亚群，重塑失衡的免疫功能，避免足细胞的免疫损伤。但有些具体机制仍有待进一步的探索和研究。