脊髓背角miR-16-5p可能通过靶向Akt3调节带状疱疹后遗神经痛

张德新，张桂友

(遵义医科大学附属医院疼痛科，贵州 遵义 563000)

带状疱疹后遗神经痛(PHN)是带状疱疹(HZ)最常见的后遗症，HZ愈合后超过1个月仍存在原皮损区疼痛，则为PHN[1]。中国医院内统计显示，HZ的发病率为7.7%，PHN的发病率为2.3%，其中29.8%的HZ患者会发展为PHN[2]。目前尚缺乏良好的PHN治疗药物及方法，其中原因之一为PHN的疼痛机制尚未阐明[3]。

MiRNA是具有调控功能的非编码RNA，主要通过与靶基因结合，抑制后者的功能。因其生物学效应显著、分子量小(22 nt左右)、易于合成和改良，具有很好的临床应用前景。神经病理性疼痛动物模型能诱导背根神经节、脊髓背角、海马及前扣带皮层中的miRNA出现差异性表达，miRNA在NP中的作用机制可能涉及神经炎性反应、突触可塑性、神经元兴奋性和DNA甲基化[4]。MiRNA作为一种微型介质，有可能成为神经病理性疼痛的生物学标志物及可能潜在的治疗靶点，从而为神经病理性疼痛提供更好的诊断和治疗方法[5]。可见miRNA参与了神经病理性疼痛的发生发展。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 雄性SPF级C57/BL6J小鼠24只，体重25～30 g，鼠龄6～8周，购于长沙天勤生物技术有限公司，证书编号：SCXK(湘)2014-0011。饲养于贵州省麻醉与器官保护重点实验室动物房。

1.1.2主要试剂 BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，上海)；CIP buffer(Exiqon，丹麦)；CIP酶(Exiqon，丹麦)；DEPC水(Solarbio，北京)；HRP标记羊抗兔二抗(博士德，武汉)；HRP标记羊抗小鼠二抗(博士德，武汉)；Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(Clontech，美国)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，日本)；RNAiso Plus(Takara，日本)；树脂毒素(RTX，Acros，美国)；RIPA裂解液(碧云天，上海)；TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus,Takara，日本)；TEMED(国药集团，上海)；兔多抗Akt3一抗(ab152157,Abcam，英国)；三氯甲烷(氯仿,川东化工，重庆)；吐温-80(Solarbio，北京)；无水乙醇(川东化工，重庆)；小鼠单抗β-actin一抗(博士德，武汉)；异丙醇(富宇，天津)。

1.1.3主要仪器 -80 ℃低温冰箱(Thermo Fisher，美国)；ATY224电子分析天平(亚莱博，杭州)；ChemiDocTM MP成像系统(Bio-Rad，美国)；Milli-Q Integral超纯水系统(Millipore，美国)；NanoDrop ND-1000分光光度计(Thermo Fisher，美国)；聚合酶链反应(PCR)仪(Bio-Rad，美国)；Plantar Test仪(IITC，美国)；von Frey纤维丝(Danmic，美国)；垂直电泳仪(Bio-Rad，美国)；低温高速离心机(Thermo Fisher，美国)；多功能酶标仪(Thermo Fisher，美国)；湿转转膜仪(Bio-Rad，美国)。

1.2方法

1.2.1PHN小鼠建模及痛阈测定 将小鼠分为PHN组和Vehicle组，每组12只，PHN组腹腔注射10 μg/kg RTX构建PHN小鼠模型，建模成功后小鼠可出现同PHN患者类似的热痛觉减退(热痛阈升高)和机械痛觉超敏(机械痛阈降低)[6-8]。Vehicle组注射等量的RTX溶剂(10%乙醇、10%吐温-80与生理盐水混合溶液)。在RTX和Vehicle注射前及注射后第 4、7、14、21、28天，通过测定PHN小鼠足底热痛阈、机械痛阈确认建模成功。

热痛阈测定：热痛阈通过检测热缩足潜伏期(TWL)采用Hargreaves热辐射法测定。保持室温18～20 ℃，将小鼠分别放在罩有有机玻璃外壳的透明玻璃表面上适应环境30 min。适应环境30 min后，使用足底辐射热痛觉测试仪(Plantar Test仪，IITC公司)，将热辐射光源直接放置在左后爪的正下方后，激活设备，记录小鼠缩足、甩腿、舔足等动作的时间，超过30 s后仍未缩足、甩腿、舔足，记录仪器自动停止时间记为30 s，每只测试3次，每次测量间隔5 min，3次测量的平均值为TWL。

机械痛阈测定：机械痛阈通过检测机械退缩阈值(MWT)，采用von Frey纤维丝测痛套件(Damic，美国)，由小到大依次使用不同力度的von Frey纤维丝由下往上垂直刺激小鼠足底皮肤，逐渐加大力度至合适刺激强度[9-10]，观察后足回缩反应(或舔足、甩腿等)时的刺激强度，在5次测量中，至少有3次出现缩足反应，测量结束，每次测量间隔5 min，3次测量的平均值为MWT。

1.2.2脊髓背角取材 在建模前及建模后的第14天分别取PHN组与Vehicle组小鼠脊髓背角。首先用七氟烷对小鼠进行麻醉，待充分麻醉后取俯卧位，暴露T11～L3段脊柱，用脊髓适配器固定小鼠脊柱。沿脊髓走形剖开小鼠皮肤及皮下组织，咬骨钳辅助暴露T13～L1脊柱下的脊髓(即脊髓腰膨大部分，脊髓L3～L5节段)，再取膨大处背侧脊髓，-80 ℃冻存直至使用。

1.2.3PCR检测miR-16-5p、Akt3表达 使用RNAiso Plus(Takara，日本)提取总RNA。采用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(Clontech，美国)和PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，日本)进行RNA的反转录。用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Takara，日本)对RNA进行扩增。使用2-ΔΔCt计算相对表达量。引物见表1。

1.2.4Western blotting检测Akt3表达 加200 μL裂解液裂(含2 μL苯甲基磺酰氟、2 μL磷酸酶抑制剂)，置于自动匀浆机中匀浆，将离心管置于冰上30 min充分裂解。30 min后，将裂解液移至1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心力4 ℃离心5 min，取蛋白上清。样品稀释20倍，用 BCA 法测定蛋白浓度。每孔加入40 μg蛋白进行电泳，将蛋白转移到 PVDF 膜上； PVDF膜用含5%脱脂奶粉TBST(封闭液)浸泡，室温摇床封闭2 h。用封闭液稀释相应一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃过夜。TBST充分洗涤5次，每次5 min。用TBST稀释相应二抗(1∶5 000稀释)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃摇床孵育2 h。TBST洗涤5次，每次5 min。将电化学发光法(ECL)试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液按1∶1比例混合，反应约2 min，将PVDF膜平放在曝光板上，将混合均匀的显影液覆盖在PVDF膜的正面充分反应，依照发光的强度选择不同的曝光时间。

2 结 果

2.1PHN小鼠模型的建立 PHN组小鼠在第14天开始出现稳定的热痛阈升高和机械痛阈的下降，Vehicle组小鼠痛阈未见变化。见图1。

2.22组脊髓背角miR-16-5p、Akt3表达情况比较 与Vehicle组比较，在建模后的第14天，PHN组miR-16-5p表达下调，Akt3表达上调；进一步用western blotting检测Akt3蛋白的表达，与Vehicle组比较，在建模后的第14天，PHN组Akt3蛋白表达上调。见图2。

3 讨 论

本研究通过RTX腹腔注射构建PHN小鼠模型，并分别在建模后第14天取脊髓背角组织。PCR检测发现，miR-16-5p在建模后第14天下调，进一步检测miR-16-5p的靶基因Akt3，发现Akt3的mRNA及蛋白表达均上调。已有多项研究报道，Akt3是miR-16-5p的靶基因[11-13]。进一步推论miR-16-5p可能通过靶向作用于Akt3，从而在PHN疼痛的发生发展中发挥重要作用。

MiRNA是具有调控功能的非编码RNA，通过转录后调控神经病理性疼痛的病理过程[14-15]。MiRNA在慢性疼痛患者和健康对照之间存在显著差异，这些异常表达的miRNA与炎症调节、伤害性信号传递及蛋白激酶功能相关[16]。BAI等[17]在2007年首次报道了炎性疼痛模型中miRNA的异常表达，在疼痛大鼠的三叉神经节中，miR-10a、miR-29a、miR-98、miR-99a、miR-124a、miR-134和miR-183的表达下调。HUANG等[18]检测HZ和PHN患者血清miRNA的表达谱差异发现，有5个miRNA可能参与了HZ向PHN转化过程。QIU等[19]通过分析PHN模型大鼠同侧背根神经节的基因表达GSE64345数据组，并通过基因本体对差异基因进行分析，分别发现了11、31个与神经病理性疼痛和炎症相关的miRNA。ZOU等[20]通过大鼠腹腔注射RTX构建PHN模型，并给予电针处理，发现电针通过增加miR-223-3p的表达抑制PHN中的神经元细胞自噬。

既往已有miR-16-5p可能参与疼痛调节的报道[21-23]。TANG等[21]通过生物信息分析发现在保留性神经损伤的神经病理性疼痛动物模型的背根神经节中，有80个差异表达的基因，并预测miR-16-5p可能参与了神经病理性疼痛发生、发展，有望成为神经病理性疼痛诊断和治疗的靶点。CCI大鼠模型的脊髓背角中miR-16表达上调，通过鞘内注射抑制剂使其表达下调，可以显著减轻CCI大鼠的热痛和机械痛觉过敏[22]。在CFA诱导的炎症性疼痛大鼠模型的脊髓背角中，miR-16表达水平降低，RAB23表达水平明显升高，通过鞘内注射miR-16可缓解疼痛，提高痛阈值，注射RAB23后加重疼痛；萤光素酶报告基因实验证实，RAB23是miR-16的直接靶基因，提示miR-16通过靶向RAB23和抑制P38 MAPK的激活来缓解慢性炎症性疼痛[23]。本课题组在临床上收集了5例PHN患者双侧皮肤，通过miRNA芯片筛查发现，与健康侧皮肤比较PHN患者疼痛侧皮肤中差异miRNA共317个，其中有67个在PHN组上调，250个下调。从芯片筛选出的差异miRNA中选取19个行PCR验证，结果显示miR-16-5p和其他5个miRNA的表达趋势和芯片结果相同[24]。以上研究提示，miR-16-5p可能参与PHN疼痛的发生、发展。

Akt是一种丝/苏氨酸激酶，又名蛋白激酶B，其是磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)下游的重要靶点，通过磷酸化、调控凋亡蛋白和转录因子介导PI3K通路的关键功能[25-26]。已有多项研究提示，Akt参与疼痛调节[27-30]。ZHANG等[27]发现，隐丹参酮通过抑制PI3K/Akt通路中Akt的磷酸化减轻CCI术后神经痛。在脊神经结扎和CCI大鼠背根神经节和脊髓背角中Akt活性增加，p-Akt增加，给予PI3K或Akt抑制剂后，可减轻模型的神经病理性疼痛[28-29]。有学者总结了PI3K/Akt通路的激活促进坐骨神经损伤、糖尿病周围神经病变、脊髓损伤、骨癌、阿片类药物引起的痛觉过敏等慢性疼痛的进展及维持[30]。

以上Akt与疼痛关系的研究，均是在总蛋白水平，既往关于Akt各亚型与疼痛的报道很少。近几年已有Akt3参与疼痛调节的研究。PASKU等[31]在腰椎间盘突出患者中分析3种Akt亚型的表达模式，发现Akt1和Akt3存在显著的正相关，在腰椎间盘突出中具有协同作用；在急性疼痛患者中Akt2表达上调，提示Akt2可能与急性炎症和吞噬相关。近年来在CCI大鼠模型中发现，miR-15a、miR-20b-5p、miR-150、miR-145表达明显降低，并预测Akt3为靶基因，通过过表达miR-15a、miR-20b-5p、miR-150、miR-145，靶向使Akt3表达下调，使CCI大鼠热痛和机械痛觉过敏缓解，提示Akt3可能参与了CCI大鼠疼痛的发生、发展[32-35]。

本研究考虑miR-16-5p的靶基因为Akt3，且已有多项研究报道Akt3是miR-16-5p的靶基因[11-13]。例如，在乳腺癌患者中发现miR-16-5p低表达，且miR-16-5p低表达的乳腺癌患者生存率低于高表达miR-16-5p患者；萤光素酶报告实验证实Akt3为miR-16-5p的靶基因，miR-16-5p通过抑制核因子-κB(NF-κB)通路和靶向作用于Akt3，抑制乳腺癌的发展[11]。在胃癌患者和胃癌细胞系中，环状RNA circNF1可与miR-16结合，萤光素酶报告实验显示miR-16抑制Akt3表达[12]。口腔鳞癌患者和细胞系中，miR-16表达下调，萤光素酶报告实验证实miR-16通过靶向作用于Akt3抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞的凋亡[13]。

以上研究均提示miR-16-5p可以通过靶向作用于Akt3发挥生物学功能，但目前还没有miR-16-5p靶向作用于Akt3调节疼痛的相关研究。尽管如此，已有研究提示miR-15a、miR-20b-5p、miR-150、miR-145等可靶向作用于Akt3参与调控CCI大鼠疼痛的发生、发展[32-35]。本研究也间接证明了miR-16-5p可能通过靶向作用于Akt3参与调控PHN疼痛的发生、发展。