幽门螺杆菌感染导致功能性消化不良的分子机制研究

胡艳霞，山韦喜，丁建红，金 哲，娄 俊，杨晓旭，杜 倩，廖秋实，石国庆，徐靖宇，谢 睿，王海波

(遵义医科大学附属医院消化病医院 遵义医科大学附属医院消化内科，贵州 遵义 563000)

功能性消化不良(Functional dyspepsia，FD)系指起源于胃、十二指肠原因不明的上消化道功能障碍性疾病，主要表现为上腹饱胀、早饱、烧心、上腹痛、恶心等不适，且诊断该病须排除可引起上述症状的器质性、代谢性和系统性疾病。罗马Ⅳ标准将功能性消化不良分为3种类型：上腹痛综合征、餐后不适综合征以及上腹痛、餐后不适重叠综合征[1]。FD具有难以完全缓解、复发性、慢性经过的特性，严重影响患者的工作、生活，是困扰临床医生的一大难题。

目前FD的病因和发病机制尚未完全明确，文献及本课题组前期工作发现FD与饮食、NSAIDS药物使用、胃肠道动力、内脏高敏性、精神心理因素以及Hp感染等多种因素有关[2]。众多的临床病例研究显示，在功能性消化不良患者中更容易检测出Hp，对Hp阳性FD患者进行根除Hp治疗有助于FD症状的改善。因此，Hp感染被认为可能是引起FD消化道症状的因素之一[2]。Hp是一种微需氧的革兰阴性螺旋杆菌，可在恶劣的胃环境中存活几十年，其主要的致病毒力因子是细胞毒相关基因A抗原(CagA)和空泡毒素A(VacA)毒力蛋白，根据是否存在CagA蛋白和VacA蛋白，将幽门螺杆菌分为I型菌株(CagA+ VacA+)和II型菌株(CagA- VacA-)，而这两者中CagA阳性菌株对胃黏膜损伤更为严重[3]。文献研究已经证实CagA可以通过Hp的Ⅳ型分泌系统进入宿主细胞，通过依赖或者独立于磷酸化的相关机制干扰细胞正常的信号转导，干扰细胞增殖及凋亡，导致胃溃疡或者胃癌[4]。前期实验研究发现与Hp感染的无症状患者相比，Hp感染的功能性消化不良患者胃黏膜的CagA阳性率明显增高，提示Hp感染后可能通过CagA影响FD患者的症状及疾病发展。临床研究发现FD患者胃黏膜5-羟色胺(5-HT)和5-羟色胺受体(5-HTR)的mRNA的表达较正常人明显增加，因此认为FD患者胃动力的改变与此相关[5]。5-HT是一种广泛分布在动物体内的神经递质，可调节包括情感、认知、机动、喂食、睡眠和伤害性感受等过程。胃肠道多种细胞内均可发现5-HTR，如肠嗜铬细胞、平滑肌细胞、分泌细胞、神经细胞等。目前的研究总结出5-HTR分为7种亚型(5-HTR1～5-HTR7)和多种亚亚型，其中5-HTR1、5-HTR3、5-HTR4分布于肠神经元上，与胃肠道功能关系密切，调控着神经递质的释放[6]。以上3种受体均参与内脏感觉的调控，其中5-HTR3和5-HTR4参与短暂的痛觉反应[7]，5-HTR1参与长时程的强烈痛觉反应。已有文献证实Hp感染后能引起体内胃泌素、多巴胺、5-HT等激素水平变化[8]，但相关机制尚不明确。

CagA可绑定在细胞膜内表面，发生磷酸化后CagA与多宿主蛋白相互作用，激活下游信号通路，如MEK/ERK、NF-kB(p65)等[9]，增强胃上皮细胞的增殖能力，上调IL-6、IL-8、TNF-a、NF-kB等促炎因子表达，其中NF-kB被认为是胃发生病理生理改变的重要介质。p65是一种多功能核转录因子，其在胃炎、胃癌发展及中枢神经系统病变中有至关重要的作用[10]。研究发现NF-kB激活后不仅影响细胞因子释放，甚至可能引起体内激素等化学物质变化，有文献证实在肠嗜硌细胞瘤的研究中证实NF-kB激活可以促进5-HT释放增加[11]，预实验也发现Hp CagA阳性的胃黏膜组织中p65的蛋白表达较Hp CagA阴性的组织明显增高，提示在胃黏膜中NF-kB很可能参与CagA相关疾病的调控机制。因此本研究将验证Hp释放的CagA侵入宿主细胞后能够激活NF-kB通路，从而影响血液中5-HT的含量及与胃肠道功能调控相关5-HT1R、5-HTR3、5-HTR4的表达，导致FD病人的消化道相关症状。本研究不仅是对Hp导致FD机制的重要补充，更为临床治疗FD提出新的治疗方向及靶点。

1 对象与方法

1.1 对象 胃黏膜组织标本来源于遵义医科大学附属医院消化内镜室，正常胃黏膜组织标本12个，Hp感染的CagA阳性的功能性消化不良患者胃黏膜组织标本12个，本研究获得患者知情同意并签署知情同意书，且通过伦理审批(伦理审批号：KLLY-2020-118)。5-HTR1、5-HTR3、5-HTR4、p-p65抗体均购买于Abcam公司；CagA抗体购买于Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 免疫组化法 12例FD-Hp+CagA+和12例健康对照组的胃黏膜组织，检测5-HTR1、5-HTR3、5-HTR4、p65的蛋白表达变化。组织常规脱蜡脱水，二甲苯 Ⅰ 10 min，二甲苯 Ⅱ 10 min，无水乙醇5 min，90%乙醇5 min，80%乙醇5 min，70%乙醇5 min，ddH2O清洗2次，PBS清洗1次，双氧水避光孵育15 min，清洗，抗原修复(柠檬酸盐，微波炉中高火10 min)清洗，一抗过夜，复温30 min，PBS清洗3次，二抗孵育30 min，PBS 洗3次，DAB显色，流水冲洗10 min，苏木素复染，流水冲洗，90%乙醇10 s，90%乙醇30 s，无水乙醇30 s，无水乙醇30 s，二甲苯 Ⅰ 3 min二甲苯 Ⅱ 3 min，中性树胶封固。结果运用IPP软件统计阳性信号值。再应用GraphPad Pism 7.0统计数据。

1.3 Western blot法 12例FD-Hp+CagA+和12例健康对照组的胃黏膜组织，检测5-HTR1、5-HTR3、5-HTR4、p-p65的蛋白表达变化。胃镜下取出新鲜胃窦黏膜组织，分装至EP管，加入RIPA裂解液，使用研磨机研钵粉碎组织块；RC-DC 法进行蛋白定量，配制 5% 的浓缩胶和10% 的分离胶，每孔加20 μg蛋白。进行SDS-PAGE 电泳(浓缩胶60 V电泳1 h，分离胶 100 V 电泳 2 h)，常规湿法转膜90 min，封闭液中封闭1 h，一抗孵育4 ℃过夜，其中5-羟色胺受体1、3、4亚型、p-p65抗体购买自Abcam公司、CagA抗体购买自Santa Cruz Biotechnology公司，稀释比例均为1∶1 000，GAPDH抗体购买自全式金生物技术有限公司，稀释比例为1∶5 000，二抗室温孵育2 h，其中鼠二抗、兔二抗均购买自中杉金桥生物技术公司，稀释比例:鼠二抗1∶5 000，兔二抗 1∶10 000。ECL化学显色，置于曝光机曝光。采用Image J软件测蛋白表达的灰度值，再应用GraphPad Pism 7.0统计数据。

1.4 统计学分析 两样本之间比较采用独立样本t检验，数据用Graphpad Prism 7软件进行统计并作图，P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 5-HTR3在正常胃黏膜组织、FD-Hp+CagA+胃黏膜组织中的表达 5-HTR3亚细胞定位主要表达于细胞质内，免疫组化结果显示，与正常胃黏膜组织相比，FD-Hp+CagA+胃黏膜组织的5-HTR3表达水平明显上调，差异具有统计学意义(t=2.539，P=0.0206，结果见图1 A～C)。

A：免疫组化法检测 5-HTR3 在人正常胃黏膜组织中的蛋白表达；B：免疫组化法检测 5-HTR3 在FD-Hp+CagA+胃黏膜组织中的蛋白表达； C：5-HTR3 蛋白在人正常胃黏膜组织及FD-Hp+CagA+胃黏膜组织中的蛋白表达比较的柱状图；*：FD-Hp+CagA+胃黏膜组织与正常胃黏膜组织比较，P<0.05。图1 免疫组化法检测5-HTR3在正常胃黏膜组织、FD-Hp+CagA+胃黏膜组织中的蛋白表达

2.2 5-HTR4在正常胃黏膜组织、FD-Hp+CagA+胃黏膜组织中的表达 5-HTR4亚细胞定位主要表达于细胞质内，与正常胃粘组织相比，FD-Hp+CagA+胃黏膜组织的5-HTR4表达水平明显上调，差异具有统计学意义(t=2.488，P=0.0223，结果见图2 A～C)。

A：免疫组化检测 5-HTR4 在人正常胃黏膜组织中的蛋白表达；B：免疫组化检测 5-HTR4 在FD-Hp+CagA+胃黏膜组织中的蛋白表达；C：5-HTR4 蛋白在人正常胃黏膜组织及FD-Hp+CagA+胃黏膜组织中的蛋白表达比较的柱状图；*：FD-Hp+CagA+胃黏膜组织与正常胃黏膜组织比较，P<0.05。图2 免疫组化法检测5-HTR4在正常胃黏膜组织、FD-Hp CagA阳性胃黏膜组织中的表达

2.3 磷酸化的NF-kB(p-p65)在正常胃粘组织、FD-Hp+CagA+胃黏膜组织中的表达 p-p65主要表达于细胞核内，与正常胃黏膜组织相比，FD-Hp+CagA+胃黏膜组织中p-p65表达水平明显上调，(t=4.340，P=0.0007，结果见图3 A～C)。

A：免疫组化检测p-p65 在人正常胃黏膜组织中的蛋白表达；B：免疫组化检测p-p65在FD-Hp+CagA+胃黏膜组织中的蛋白表达；C：p-p65 蛋白在人正常胃黏膜组织及FD-Hp+CagA+胃黏膜组织中的蛋白表达比较的柱状图；**：与正常胃黏膜组织比较，P<0.01。图3 p-p65在正常胃黏膜组织、FD-Hp+CagA+胃黏膜中组织的表达蛋白

2.4 Western blot法检测5-HTR3、5-HTR4、p-p65蛋白在正常胃黏膜组织、FD-Hp+CagA+胃黏膜组织中的表达 Western blot结果显示，与正常胃黏膜组织相比，5-HTR3蛋白在FD-Hp+CagA+胃黏膜组织中表达明显升高，差异具有统计学意义(t=2.748，P=0.0117，结果见图4 A)；与正常胃黏膜组织相比，5-HTR4蛋白在FD-Hp+CagA+胃黏膜组织中表达明显升高，差异具有统计学意义(t=2.340，P=0.0374，结果见图4 B)；与正常胃黏膜组织相比，p-p65蛋白在FD-Hp+CagA+胃黏膜组织中表达明显升高，差异具有统计学意义(t=5.446，P=0.0055，结果见图4 C)。

A：5-HTR3蛋白在人正常胃黏膜组织、FD-Hp+CagA+胃黏膜组织中的表达B：5-HTR4蛋白在人正常胃黏膜组织、FD-Hp+CagA+胃黏膜组织中的表达；C： p-p65蛋白在人正常胃黏膜组织、FD-Hp+CagA+胃黏膜组织中的表达； * 、**：与对照组比较，P<0.05，P<0.01。图4 Western blot法检测5-HTR3、5-HTR4、p-p65在正常胃黏膜组织、FD-Hp+CagA+胃黏膜组织中的表达水平

3 讨论

功能性消化不良严重影响患者的工作和生活，随着社会的发展以及人民生活质量的提高，FD的治疗更是刻不容缓。在引起FD消化道症状的众多因素中，Hp感染是否在其中发生重要作用，近年来备受关注。大量的人群调查研究显示,大部分的FD患者同时感染Hp[12]，对Hp阳性FD患者进行根除Hp治疗有助于FD症状的改善，但相关机制鲜有报道。本研究不仅是对Hp导致FD机制的重要补充，更为临床治疗FD提出新的治疗方向及靶点。

前期实验研究发现与Hp感染的无症状患者相比，Hp感染的功能性消化不良患者胃黏膜的CagA阳性率明显增高，提示Hp感染后可能通过CagA影响FD患者症状的发生及疾病发展。有研究证实Hp感染后能引起体内5-羟色胺水平的变化[8]，但相关机制尚不明确。亦有临床研究发现FD患者胃黏膜5-羟色胺和5-羟色胺受体的mRNA的表达较正常人明显增加，因此认为FD患者胃动力的改变与此相关[5]。实验证实CagA阳性胃黏膜组织中5-HTR3、5-HTR4的表达较正常胃黏膜明显增高，提示5-HTR3、5-HTR4介导了Hp感染的功能性消化不良患者的消化道症状的发生。NF-kB是一种多功能核转录因子，其在胃炎、胃癌发展及中枢神经系统病变中有至关重要的作用[10]。本研究实验也证实了CagA阳性胃黏膜组织中磷酸化NF-kB的表达较正常胃黏膜明显增高，在细胞实验中也验证了此现象，提示在胃黏膜中NF-kB参与了Hp感染的功能性消化不良患者的消化道症状的调控。

综上所述，Hp释放的CagA侵入宿主细胞后可能激活NF-kB通路影响与胃肠道功能调控相关的5-HTR3、5-HTR4的表达，从而介导FD病人的消化道相关症状，为临床治疗FD提出了新的治疗方向及靶点。