养肺控瘤方通过Beclin-1促进自噬并抑制肺癌细胞A549转移*

沈水杰，陈 璇，顾小侠，姜水菊，姚登福

（1.南通市中医院，江苏 南通 226000；2.苏州科技城医院，江苏 苏州 215153；3.南通市第三人民医院，江苏 南通 226000；4.南通大学附属医院，江苏 南通 226001）

与I型细胞程序性死亡凋亡不同，自噬被认为是属于II型细胞程序性死亡的细胞死亡机制[1]。在生理条件下，自噬通过清除受损的细胞器、蛋白质聚集体和细胞内病原体等途径，对应激条件下细胞内稳态的维持起关键作用。在癌症的病理状态下，诱导自噬激活细胞死亡（称为自噬样细胞死亡）可以有效促进肿瘤细胞的清除[2-4]。有相关研究表明，在癌症治疗药物的开发中，药物对细胞自噬作用的影响是一个很有价值的研究方向[5]。

中医药的使用已经延续了几个世纪，在预防和消除肿瘤细胞方面，中药已被证实能够发挥重要作用[6]。临床治疗、动物及细胞试验的研究表明：中药具有抑制肿瘤发生、转移和血管生成的作用[7-8]。养肺控瘤方（yangfeikongliu formula，YKF），以生黄芪、生晒参补益肺脾，益气固本，北沙参养阴润肺，薏苡仁、仙鹤草健脾补虚，白花蛇舌草清热解毒散瘤，全方起益气养阴，消瘤散结之效[9]。已有研究表明：YKF联合顺铂可抑制荷瘤小鼠癌细胞中Lewis肺肿瘤细胞的生长和转移[10]。此外，YKF能抑制肿瘤生长，与顺铂协同降低Lewis晚期肺癌小鼠模型血清IL-2、TNF-α的表达[11]。但目前对于YKF影响肺癌细胞自噬作用的相关研究仍较少。

据报道，自噬相关蛋白，如Beclin-1、LC3和p62等，在癌组织中的表达减少与癌症预后不良有关，并可能影响恶性肿瘤的发展或进展[12-14]。Beclin-1是一种重要的自噬相关蛋白，是自噬体形成所需的III类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K-III）复合物的核心成分。Beclin-1通过抑制MCF7细胞中荷瘤小鼠体外细胞生长和体内肿瘤发生的发挥其作用[15]。LC3也是通过磷脂酰乙醇胺（PE）结合形成自噬体所必需的成分之一。因此，通常通过跟踪荧光标记LC3或在SDSPAGE凝胶上检测快速迁移的脂化LC3（LC3-II）和LC3-I的强度比来观察自噬活性[16]。p62（SQSTM1）是一种通过与LC3进行相互作用而发挥功能的自噬关键分子，p62的上调/下调与肿瘤形成、促进和抗癌治疗有关[17]。目前，YKF诱导的A549细胞自噬相关蛋白的变化尚未清楚。

本研究通过检测p62和Beclin-1的表达、LC3 II/I比值、电子显微镜下的自噬体和LC3斑点来评估YKF在A549细胞自噬中的作用。

1 材料和方法

1.1 YKF和含YKF的血清制备 养肺控瘤方购自南通市中医院中药房。组成：生黄芪45 g，生晒参15 g，北沙参 30 g，白花蛇舌草 30 g，仙鹤草 30 g，薏苡仁30 g。药物以等效人剂量的5倍，10倍和15倍煎煮。剂量转换根据《中药药理学实验方法学（第3版）》提供的方法进行换算。

将雄性SD大鼠随机分为4组制备含药血清，分别为对照组、5倍剂量组（5×）、10倍剂量组（10×）和15倍剂量组（15×）。药物治疗组给予YKF 3 g/mL、6 g/mL、9 g/mL（相当于 5倍、10倍和 15倍剂量），对照组给予等量蒸馏水。每组每天以3 mL/次进行2次灌胃（早晨和晚上）。在第6次灌胃后2 h收集血液以制备含YKF的血清。灭活和灭菌后，将血清储存在冰箱中供以后使用。动物试验严格遵守美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH Pub.No.85-23，1996修订），并经南通市中医院伦理委员会批准。

1.2 细胞培养 肺癌A549细胞系从国家认证细胞培养物收藏中心（中国上海）获得。含有青霉素-链霉素的Opti-MEM（Gibco）用于培养细胞。对于含有YKF的血清处理，将A549细胞接种在6孔板中并培养过夜。第2天，将细胞在不同剂量含有10%YKF血清的新鲜完全培养基中培养48 h。使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理细胞以干扰自噬体的形成。

1.3 电子显微镜检测自噬 药物处理48 h后，将细胞消化并重悬于PBS中。细胞用PBS洗涤3次。离心后，沿着管壁加入2.5%戊二醛并在4℃下固定过夜。第2天，用PBS固定细胞并漂洗3次，然后，用1%四氧化锇在4℃固定30 min。将不同浓度的丙酮连续加入到细胞中进行脱水（顺序为50%，70%，90%，100%）。将细胞与稀释的包埋剂在室温下混合30 min，并在室温下用纯包埋剂代替过夜。将细胞质量移至胶囊底部并加入包埋溶液的混合物。然后，将它们在60℃的烤箱中烘烤以凝固成一个硬块。将硬块切成约1μm厚的半薄切片并用醋酸钠和柠檬酸铅染色。在电子显微镜下观察自噬体。当自噬体和溶酶体融合形成自噬体时，它们呈现单层结构。

1.4 mRFP-GFP-LC3慢病毒载体制备和自噬流检测在293 T细胞中制备pLVX-puro-mRGP-EGFPLC3B慢病毒载体，将293 T细胞接种在培养皿中并培养至80%时传代。将5μg pLVX-puro-mRGPEGFP-LC3B，5μg psPAX2和 5μg pMD2.G的质粒混合物溶解于600μL opti-MEM中。并制备另一种20μL lipo3 000和600μL opti-MEM的混合物。将2种混合物溶液混合后在室温下放置20 min，加入细胞培养皿中。细胞培养48 h。收集上清液以获得慢病毒载体，并用0.45μm过滤器过滤。通过超速离心浓缩慢病毒载体，并用0.22μm过滤器过滤。然后，测量了病毒滴度。为了检测A549细胞中的自噬流，将对数生长阶段的细胞以每孔5×104个细胞接种到24孔板中。接着，将细胞置于细胞培养箱中过夜。第2天，每个孔以MOI=20的病毒量加入新鲜培养液。感染24 h后，去除含有病毒的培养基。共孵育48 h后，将细胞用多聚甲醛固定并密封。用共聚焦显微镜观察绿色斑点和红色斑点，并以800×拍照。

1.5 细胞转染 用无菌PBS洗涤对数生长阶段的A549细胞1次，并用胰蛋白酶消化。将细胞沉淀重悬于完全培养基中。计数后，将细胞以每孔3×105个/m L接种到6孔板中，并置于细胞培养箱中过夜。第2天，将Si-Beclin-1-1/2/3或siRNA阴性对照（NC）与Lipofectamine 3 000混合，并加入细胞培养液中。将细胞置于细胞培养箱中6 h，然后换成完整的培养基再培养48 h。最后，收集细胞用于进一步试验。

1.6 实时定量PCR（qRT-PCR） 为了确定Beclin-1 mRNA的表达水平，使用qRT-PCR分析不同方法处理的细胞。用RNAiso Plus（Trizol）加入细胞并充分裂解，并通过光谱仪测定RNA的纯度和浓度。使用 PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）（TAKARA）将等质量的RNA逆转录成cDNA。以ABI ViiA7荧光定量PCR仪中的Power SYBR Green PCR Master Mix（Thermo）扩增系统为基础，利用cDNA产物进行实时定量扩增。实时定量PCR的引物为：

Beclin-1 mRNA的表达水平相对于GAPDH。

1.7 CCK-8 将每孔以104的细胞接种在96孔板中并置于培养箱中过夜。第2天，将细胞与含有10%YKF血清的完整培养基分别培养24 h、48 h、72 h。孵育时间后，将96孔板的每个孔中加入10 μL CCK-8溶液并再温育2 h。在450 nm处测量每个孔的吸光度。

1.8 蛋白质印迹 处理过的细胞用PBS洗涤，然后在结冰条件下使用RIPA裂解物（Beyotime，Shanghai，China）裂解30 min。离心后收集的上清液是总蛋白质。基于BSA方法定量每个蛋白质样品。等质量的蛋白质在SDS-PAGE和电泳分离上加载缓冲中加载。将蛋白质从凝胶上转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭非特异性蛋白质，并用第一抗体印迹特异性蛋白质。印迹在用Millipore ECL系统孵育第二抗体和化学发光后可视化。第一抗体是anti-Beclin-1，anti-p62，anti-LC3，和 GAPDH（PROTEINTECH）。第二抗体是HRP标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）（Beyotime）。

1.9 Transwell细胞迁移和侵袭实验 用胰蛋白酶消化A549对数生长期细胞，并用PBS洗涤。将细胞重悬于无血清培养基上，细胞密度调整至4×105个/m L。将直径为8μm的Transwell小室置于含有培养基的24孔板中。将200μL细胞悬浮液加入到上层小室中并培养48 h。取出小室并用PBS洗涤，并用4%多聚甲醛（PFA）固定20 min。细胞用结晶紫染色溶液染成紫色。将带有细胞的小室置于载玻片上并在显微镜下观察。Transwell分析细胞侵袭能力的方法与上述方法相同除了需要除了在Transwell小室中添加基质胶以及在Transwell上室添加105个细胞外。

1.10 数据处理 试验数据采用SPSS 21.0进行分析，并用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验统计，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 YKF含药血清促进A549细胞的自噬作用 分别用含5×、10×、15×YKF的血清对A549细胞处理48 h，并评估YKF对细胞活力的影响。见图1A左。结果显示：含YKF的血清剂量越高，细胞活力越低，但3组间细胞活力差异无统计学意义（P＞0.05），表明较高剂量的YKF并不具有更好的抑制细胞活性的能力。选择含有5×YKF的血清对A549细胞处理24 h、48 h、72 h，并进行CCK-8活力测定。见图1A右。结果显示：细胞活力随着处理时间的增加而降低。

图1 养肺控瘤方（YKF）促进A549细胞自噬

使用蛋白质LC3 II/LC3 I比值来观察自噬体的形成和自噬情况。为了评估YKF对A549细胞自噬的影响，用含YKF的血清处理A549细胞48 h后，检测细胞中LC3 II/I比值、p62和Beclin-1的表达。见图1B。结果显示，LC3 II/I比值升高，p62和Beclin-1表达水平增加，（P＜0.001）。结果表明：YKF 可能诱导A549细胞的自噬性死亡。

2.2 通过3-MA抑制自噬逆转YKF对A549细胞的促进自噬作用 选择含5×YKF的血清处理48 h的A549细胞。并在放大13 000倍的电子显微镜下观察其自噬情况。见图2A。为了进一步确定YKF的自噬促进作用，我们比较了含5×YKF血清处理的A549细胞用3-MA抑制自噬剂或不用3-MA抑制自噬剂后的LC3斑点。结果显示，与阴性对照组相比，含5×YKF血清可诱导LC3斑点增加，而这种增加在3-MA处理后消失，表明YKF对A549细胞发挥促进自噬的作用。见图2B。

图2 3-M A抑制自噬对YKF诱导的A549细胞自噬的影响

2.3 沉默Beclin-1逆转了YKF对A549细胞的促进自噬作用 我们通过siRNA干扰质粒转染敲除A549细胞中的Beclin-1，并检测其对细胞活力的影响。经si-Beclin1-1、si-Beclin1-2 和 si-Beclin1-3 转染A549细胞后，仅si-Beclin1-2能诱导Beclin-1下调，（P＜0.01）。因此，在以下试验中选择si-Beclin1-2来沉默Beclin-1。见图3A。沉默Beclin-1降低了YKF诱导的LC3II/I比值和p62表达水平。同样，3-MA也达到了与沉默Beclin-1相同的效果，抑制了LC3II/I比值和p62的表达水平，表明YKF诱导的A549细胞自噬依赖于Beclin-1。见图3B。以上结果表明：Beclin-1沉默和3-MA均可逆转YKF诱导的细胞活力下降（P＜0.001）。见图3C。

图3 沉默Beclin-1可逆转含YKF的血清对A549细胞的自噬促进作用

2.4 沉默Beclin-1逆转含YKF的血清抑制细胞迁移 为了进一步确定YKF的抗肿瘤特性，研究含YKF血清对A549细胞迁移的影响。结果显示，与对照组相比，含5×YKF血清导致迁移的细胞数量显著减少（P＜0.001）。在Beclin-1沉默的A549细胞中加入含5×YKF的血清。与含5×YKF血清和si-Beclin-1阴性对照细胞相比，Beclin-1沉默的A549细胞迁移更多（P＜0.05）。此外，与含5×YKF的血清和si-Beclin-1阴性对照细胞相比，自噬抑制剂3-MA处理的A549细胞迁移更多（P＜0.01）。这些数据表明，YKF通过影响自噬和Beclin-1来抑制A549细胞迁移。见图4。

图4 沉默Beclin-1逆转含YKF的血清抑制A 549细胞迁移

2.5 沉默Beclin-1逆转含有YKF的血清对细胞侵袭的抑制作用 通过沉默Beclin-1逆转含YKF的血清以抑制A549细胞侵袭。结果显示，与空白组相比，含5×YKF的血清导致侵袭细胞数量显著减少（P＜0.001）。将含5×YKF的血清添加到Beclin-1沉默的A549细胞中。与5×YKF的血清和si-Beclin-1的阴性对照细胞相比，Beclin-1沉默的A549细胞侵袭性更强（P＜0.05）。此外，与含5×YKF的血清和si-Beclin-1的阴性对照细胞相比，3-MA处理的A549细胞侵袭性更强（P＜0.01）。这些数据表明，YKF通过影响自噬和Beclin-1来抑制A549细胞侵袭。见图5。

图5 沉默Beclin-1逆转含YKF的血清以抑制A549细胞侵袭

3 讨论

近几十年来，许多形式的补充医学和替代医学在世界范围内得到了广泛应用，在改善癌症患者的生活质量方面发挥了作用[18]。在中国，中医药被广泛接受，并成为有益于癌症患者补充疗法和替代疗法的重要手段[6]。许多抗癌中药方剂已应用于临床，并对癌症患者产生了有益的效果。中草药治疗非小细胞性肺癌的Meta分析表明，中草药可以有效提高患者生存质量和延长生存期，在疗效、安全性和控制成本方面均具有显著的优势[19-20]。本研究作为以细胞试验为主的基础研究，证实了YKF在促进肺癌细胞A549自噬、抑制肺癌细胞活力、迁移、侵袭等方面可发挥重要作用。

自噬在肿瘤存活或细胞死亡中具有复杂的双重作用[1]。调控自噬是否有利于消除癌症目前尚不清楚。许多研究表明天然药物或药物成分可以诱导癌细胞的自噬性死亡，如丹参酮[21]，堪非醇[3]和重楼皂苷VI[22]。许多中国传统药物或草药提取物可诱导肺癌细胞自噬性死亡[23-25]。本研究结果显示：YKF可抑制肿瘤细胞活力，促进A549细胞中自噬相关蛋白（Beclin-1、p62和LC3 II/I）的表达和自噬体的形成，进一步证实YKF可诱导A549细胞的自噬性死亡。同时，YKF对A549细胞可发挥抗细胞迁移和侵袭的作用。综合来看，YKF对A549细胞能够起到有效的抗肿瘤活性的作用。

恶性细胞常常会表现出自噬缺陷和自噬相关蛋白的异常模式。Beclin-1作为自噬的核心蛋白，显示出异常的表达模式和/或活性，这些异常与致癌作用呈正相关或负相关[26-28]。文献报道，基于小鼠Beclin-1基因敲除的研究[29]表明Beclin-1的杂合破坏导致体内细胞增殖增加和自噬减少，并表明Beclin-1或其他自噬基因的突变可能有助于人类癌症的发病机制。例如，有研究发现Beclin-1在胰腺癌和前列腺癌症等癌症患者中表达下调[30-31]。此外，具有抗癌特性的药物对Beclin-1的抑制作用有利于癌症细胞的去除[32]。本研究发现在含YKF血清诱导的A549细胞活力下降和自噬增加的情况下，Beclin-1的表达水平显著提高，而基因敲除抑制了YKF对A549细胞LC3 II/I比值、p62表达、迁移和侵袭的影响。由此，我们可以推断，Beclin-1是YKF诱导细胞自噬、抑制A549细胞迁移和侵袭的抗癌特性中的一个关键性分子。

综上所述，本研究发现：YKF对肺癌A549细胞具有很强的抗癌作用。此外，A549细胞的Beclin-1依赖性自噬死亡是YKF抑制肺癌进展的机制。本研究基于传统处方YKF进行的基础试验来阐明抗癌药物YKF的作用机制，以期在未来的肿瘤治疗中提供更多科学依据和思路。