脑梗死半暗区星形胶质细胞形态学定量分析及临床意义

马瑞宁，侯惠莲，柳 雨，张冠军，王鸿雁，宫惠琳，杨 喆

(西安交通大学第一附属医院病理科，陕西 西安 710061)

高血压引起的脑梗死伴出血病情发展迅速，病死率及致残率均较高，严重危害人们的健康[1-2]。高血压病患者的血管壁玻变增厚，使脑部血流血液循环障碍，缺血、缺氧引起脑梗死，由于梗死区域血管重建，恢复血流灌注，从而导致继发性出血，引起脑组织复杂的病理变化，严重影响神经功能恢复及神经再生。而脑梗死周围半暗区星形胶质细胞的活化增生可以促进神经功能的恢复[3]，成为近年来的研究热点，受到人们的重视。研究认为，脑梗死周围半暗区星形胶质细胞活化、反应性增生，并且这些活化增生的星形胶质细胞形态结构发生了显著改变，包括细胞体积肥大、突起增粗、变长等，限制了组织损伤，有助于脑组织神经元功能的恢复[4]，尚有争议，其机制尚不清楚，而且研究者多局限于动物实验的定性分析[5]，对于人体脑组织梗死出血后星形胶质细胞的变化及其计算机智能量化分析，国内外文献报道甚少[6]，尚待进一步研究证实。胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)是星形胶质细胞特异蛋白和骨架成分之一， GFAP表达的强弱能够反映胶质细胞的功能状态，被公认为胶质细胞的特征性标记物[7]。 本实验采用免疫组织化学法检测人体脑梗死周围半暗区GFAP的表达，测定GFAP表达的星形胶质细胞体的面积、突起长度，兹在分析探讨脑梗死后周围半暗区星形胶质细胞的形态学变化，为进一步研究脑梗死后神经功能的恢复提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2018年1月至2019年6月间我院病理科归档确诊的临床病理资料完整的高血压引起脑梗死伴继发出血的患者行小骨窗微创开颅手术、石蜡包埋及切片标本63例，以每例梗死伴出血旁正常脑组织为对照组。其中男37例，女26例；年龄42～86岁，平均年龄(60.63±9.38)岁，63例患者头颅CT或MRI显示颅内出血量约5～15 ml，从初次发病到手术时入院时间在6～23 d。病例纳入标准：①患者均具有高血压病史[收缩压≥140 mmHg，或者(和)舒张压≥90 mmHg，或正在服用抗高血压药]；②初次发病经头颅CT或MRI检查确诊为脑梗死；③入院时均有头痛、呕吐、意识障碍等临床症状。排除标准：①存在严重的心、肺、肝、肾等重要器官功障碍；②脑动脉瘤，小脑、脑干出血者；③严重心脏瓣膜病变；④恶性肿瘤、血液系统疾病；⑤伴有其他神经系统疾病；⑥临床资料不完整等。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 免疫组化染色及其结果测定 ①采用Max-Vision 即用型快速免疫组织化学一步法检测GFAP表达：兔抗人GFAP单克隆抗体及其试剂盒及DAB显色试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。具体操作按说明书进行，一抗稀释度GFAP(1∶400)，苏木素复染核，DAB显色。阳性对照为已诊断的脑星形细胞瘤，用PBS代替一抗作阴性对照。免疫组化染色的阳性信号为棕黄色。②GFAP阳性细胞计数：GFAP阳性表达在细胞质及突起，呈棕褐色，轮廓清楚，细胞突起呈星形，采用图像分析系统分析被检测细胞单位面积(mm×mm)的阳性数，在高倍镜下(×400)选择5个单位面积的阳性数求其平均值即为GFAP阳性细胞数[8]。

1.3 星形胶质细胞胞体面积及其突起长度测定 用Image-Pro Plus 5.0软件测星形胶质细胞分支突起长度作为其突起长度，即：每次在高倍镜下(×400)选择5个视野星形胶质细胞分支突起长度，求其平均值即为星形细胞突起长度；在高倍镜下(×400)选择一个视野测5个星形胶质细胞，取其平均值作为一个视野的星形胶质细胞胞体面积，随机选取5个视野求其平均值即为星形胶质细胞胞体面积。

2 结 果

2.1 脑出血梗死周围半暗区病理组织学特征及免疫组化GFAP的表达 HE染色光镜下显示，正常脑组织细胞形态结构完整，细胞数目未见减少，无核固缩现象及炎性细胞浸润(图1A)。梗死区不规则，周围半暗区脑组织水肿，神经元数目减少，呈三角形、核固缩，有中性粒细胞、淋巴细胞等炎细胞浸润，星形胶质细胞增生，肉芽组织形成(图1B)。GFAP阳性表达在所观察目标组织星形胶质细胞、神经元、小胶质细胞胞质。本实验主要观察其在星形胶质细胞中的表达。在周围正常脑组织中，GFAP 表达的阳性星形细胞均匀分布，胞体较小，突起呈分支状较纤细，呈放射状分布(图1C)。在梗死灶周围半暗区，GFAP 标记的阳性星形胶质细胞数目增多，细胞体面积增大，突起增长、互相交织成网，聚集在病灶边缘，并可见少量深入梗死灶(图1D)。

A：对照正常人体脑组织的相应区域 (HE染色，×200);B：脑梗死半暗区肉芽组织(HE染色，×200);C：对照正常人体脑组织的相应区域GFAP 标记阳性的星形胶质细胞均匀分布，胞体较小，突起呈分支状(En Vision法染色，×200);D：脑梗死半暗区，GFAP标记阳性的星形胶质细胞胞体面积增大，突起增长、互相交织成网 (En Vision法染色，×200)

2.2 脑梗死周围半暗区GFAP表达的星形胶质细胞数目、细胞体面积、突起长度的变化 见表1。GFAP表达的星形胶质细胞的阳性细胞数在脑梗死周围半暗区明显高于周围正常脑组织(P<0.01)。采用Image-Pro Plus 5.0软件测量结果显示，在周围正常脑组织中，星形细胞的胞体面积较小，突起较短(图2A)；在梗死灶周围半暗区星形胶质细胞的细胞体面积增大，突起增长、互相交织成网(图2B)。两者之间比较差异具有统计学意义(P<0.01)。

表1 脑梗死周围半暗区GFAP 标记的阳性星形细胞数、细胞体面积、细胞突起长度测定结果

A：正常脑组织的相应区域，星形胶质细胞胞体面积较小，突起较短(×400)；B：脑梗死半暗区，星形胶质细胞胞体面积较大，突起增长、互相交织成网(×400)

2.3 脑梗死周围半暗区星形胶质细胞体面积、数目与其突起长度相关性分析 直线相关分析显示，在脑出血梗死周围半暗区，GFAP表达的星形胶质细胞阳性细胞数与星形胶质细胞体面积无相关性(r=0.246，P>0.05)，与星形胶质细胞突起长度无相关性(r=-0.118，P>0.05)。说明在人体脑梗死周围半暗带区，星形胶质细胞数目的增加与其细胞体增大及突起长度的伸长无关联性，是相互独立的，表明反应性增生的星形胶质细胞形态学特征多样，可表现为其细胞体积的增大，或仅表现为细胞突起的伸长。

3 讨 论

高血压引起的脑梗死病情发展迅速，严重危害人们的健康[9-10]。在脑梗死区，一方面，由于梗死灶内血管壁发生缺血，血栓溶解、栓子破碎、移向远端，使血管再通，血流再灌注，在血压的作用下缺血坏死的血管破裂而形成出血性梗死；另一方面，梗死边缘侧支循环开放，血管扩张充血，造成梗死边缘坏死，易致血液从受损的毛细血管漏出，发生梗死周围点片状出血[11]。此外，梗死后脑水肿使脑梗死周围组织毛细血管受压而发生缺血坏死和内皮损害，血管壁通透性增强，易致血液从受损的毛细血管漏出，发生梗死周围脑组织出血，由此引起脑组织一系列复杂的病理变化，引起严重的脑神经功能的损害。本组结果显示，患者因高血压引起脑梗死，进而伴出血，其病理学特征表现为，脑组织局灶区坏死，形态不规则，周围形成暗红色的半暗区，表现为脑组织水肿，神经元数目减少，呈三角形、核固缩，有中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，星形胶质细胞增生，肉芽组织形成。

研究认为，脑梗死周围半暗区星形胶质细胞的活化增生可以促进神经功能的恢复[3]。脑梗死出血后神经功能恢复的关键是神经元再生和神经结构重建。多数学者研究认为，胶质细胞在脑梗死出血后中枢神经系统中起着重要作用，不仅对神经元细胞起支撑、营养、保护、免疫调节等作用，而且构成了神经信息传导的重要部分[8]。郭金赫等[12]研究发现，脑梗死周围半暗区星形胶质细胞活化，细胞大量分化增殖，反应性增生，同时，GFAP等相关蛋白的增加，对神经元具有保护作用，间接地促进神经功能的恢复。GFAP是星形胶质细胞的重要的细胞骨架蛋白，主要存在于脑星形胶质细胞中[13-14]。GFAP阳性表达的星形胶质细胞增殖可能是具有保护神经元和微血管活性的星形细胞，在发生脑梗死后的反应性胶质细胞中尤为明显，因此常作为分化和反应性胶质细胞的标记物[15-16]。本组结果显示，在人体脑梗死周围半暗区GFAP表达的阳性细胞数显著升高，说明该区星形胶质细胞发生了反应性增生。

近年研究发现，脑梗死后，周围半暗区星形胶质细胞形态学结构亦发生了变化，包括胞体肥大、肿胀、突起增多、延长，并朝着坏死区迁移，形成一道屏障,将其与周围正常区隔离，防止细胞损伤的扩散，同时为神经元提供营养支持，维持神经元的存活，对神经元的保护作用，有助于神经功能的恢复[17-18]。新近，随着计算机人工智能在神经病理学中的应用，采用计算机图像分析对细胞进行科学精准的测量，这一新的技术能够准确地显示脑梗死半暗区星形细胞胞体肥大、突起延长，并进行量化分析，简便易行，省时省力，对研究神经元及胶质细胞功能具有划时代意义[19]。本组结果显示：人体脑梗死周围半暗区星形胶质细胞不但数目明显增加，而且其细胞体面积增大、突起变长，说明星形胶质细胞发生形态结构的改变。推测这种反应性胶质细胞可能具有恢复细胞外环境成分和刺激自我修复的作用，并对神经元的生长和存活具有促进作用，有助于颅脑损伤的修复。间接证实星形胶质细胞参与了梗死灶神经修复和再生的过程。

另有研究[20]发现，过度增殖的星形胶质细胞会抑制神经元的发育和生长。随着脑梗死区星形胶质细胞大量聚集，细胞间的生长相互叠加和覆盖，GFAP 过度表达形成胶质瘢痕。胶质瘢痕作为物理、化学屏障，可以局限于梗死区，从而发挥保护作用,然而，脑梗死区中的某些有害分子可经渗透通过胶质瘢痕，导致神经变性，阻止了神经元轴突的再生，抑制神经修复并引起严重的组织损伤，甚至使坏死区扩大，引起免疫性炎性反应等。本结果还显示，在脑梗死周围半暗区，GFAP 标记的阳性星形胶质细胞突起互相交织成网，聚集在病灶边缘，有形成胶质瘢痕的趋势。推测可能会抑制神经修复并引起组织损伤。

总之，高血压引起脑梗死出血后，神经胶质反应性改变对神经功能修复的影响是一个复杂的过程。星形胶质细胞反应性增生，GFAP在其周围半暗区表达明显升高，并且这种反应性增生的星形胶质细胞的形态结构发生了改变，间接说明星形胶质细胞参与并促进了梗死灶神经修复和再生的过程。