高效液相色谱法测定芦笋中甲基硫菌灵 残留量方法研究

杨永华，刘 新

(1.宁德市农业科学研究所，福建福安 355017；2.福建省农业农村厅，福州 350000)

甲基硫菌灵是一种低毒、广谱杀菌剂，具有内吸、预防和治疗作用[1]。它主要通过一系列生化反应，产生能够干扰病菌菌丝分裂的物质，使病菌孢子萌发长出的芽管细胞壁扭曲畸形，病菌无法正常生长而达到杀菌效果[2]。甲基硫菌灵可广泛用于防治粮食、花卉、果树和蔬菜等作物的多种病害，如芦笋褐斑病、茎枯病等。芦笋口味鲜美，营养价值高，深受国际市场欢迎，我国芦笋种植面积广，在全球芦笋贸易中占有重要地位。但据报道，近年来我国有约65%芦笋由于农药残留超标出口受阻[3]。加强农药残留检测在应对国外严格的绿色贸易壁垒上具有重要作用。有关枸杞[4]、芒果[5]、猕猴桃[6]、马铃薯[7]中甲基硫菌灵的残留分析已有文献报道，但未见甲基硫菌灵在芦笋中残留分析研究，建立一种准确、可靠且操作简便的芦笋中甲基硫菌灵残留量分析方法，具有重要现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与设备

Waters 2695高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；N-EVAP 112型氮吹仪(美国Organomation公司)；BP221S分析天平(德国赛多利斯股份公司)；HR1727搅拌器(飞利浦公司)；T25高速匀浆机(德国IKA公司)；冷冻离心机(德国Sigma公司)；MS 3 digital涡旋振荡器(德国IKA公司)；移液枪、具塞量筒、烧杯、锥形瓶、0.45 μm滤膜等。

1.1.2 试剂与药品

甲基硫菌灵标准品(日本曹达有限公司)；三乙胺、氯化钠、磷酸(均为分析纯，国药集团试剂有限公司)；乙腈、甲醇、丙酮、癸烷磺酸钠(均为色谱纯，国药集团试剂有限公司)；无水硫酸镁(分析纯，国药集团试剂有限公司)；乙二胺基-N-丙基(PSA)(美国CNW公司)。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

甲基硫菌灵标准溶液：准确称取0.01 g (精确至0.001 g)甲基硫菌灵标准品至100 mL容量瓶中，用甲醇溶解，充分振荡混匀后定容，保存于4 ℃冰箱中，备用。

1.2.2 离子对试剂配制

癸烷磺酸钠溶液：准确称取癸烷磺酸钠固体1.0 g (精确至0.1 g)至1 000 mL容量瓶中，加200 mL超纯水充分溶解后，再加入10 mL三乙胺和7 mL磷酸，充分混匀后用超纯水定容，保存于4 ℃冰箱中，备用。

1.2.3 样品前处理

准确称取25 g样品于烧杯中，加入50 mL乙腈提取液后用高速匀浆机匀浆2 min，匀浆液过滤至装有5 g氯化钠的100 mL具塞量筒中，盖上塞子，充分振荡2 min后室温静止30 min，待乙腈相和水相完全分层后，准确吸取10 mL上层乙腈于离心管中氮吹至近干，用1 mL甲醇溶解，充分振荡后加入45 mg PSA和180 mg无水硫酸镁，5 000 r/min离心15 min，取0.5 mL上层离心液加入0.5 mL离子对试剂，充分振荡，过0.45 μm滤膜后，待测。

1.2.4 高效液相色谱检测条件

色谱柱：Waters XBridge C184.0 mm×250 mm；流动相：甲醇+离子对试剂(体积比50∶50)；流速：0.8 mL/min；检测波长：270 nm；柱温：25 ℃；进样量：30 μL。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

在0.1～20 mg/L范围，配制不同浓度的甲基硫菌灵标准系列溶液，根据1.2.4节中的高效液相色谱检测条件，进行3次平行测定，以测得的峰面积平均值为纵坐标，相对应的甲基硫菌灵标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线(图1)，其线性回归方程为y=129 898x-51 214，R2=0.999 0。

2.2 前处理条件

2.2.1 提取溶剂确定

甲基硫菌灵溶于丙酮、甲醇、乙腈，微溶于己烷，几乎不溶于水[8]。试验选用丙酮、乙腈、甲醇3种溶剂为萃取溶剂，通过添加回收试验，分析萃取效果。结果表明，丙酮为提取试剂时，其回收率明显低于甲醇和乙腈；甲醇为提取试剂时，萃取过程分层现象不明显，不易分辨；乙腈为提取试剂时，试验效果最为理想，回收率高且样品杂质少。

2.2.2 样品浓缩

对添加2 mg/kg甲基硫菌灵的芦笋、芦笋植株、土壤样品，提取试验后分别经过浓缩(氮吹)与不浓缩处理，每个处理设计3个重复。结果表明(表1)，采用氮吹法对样品进行浓缩处理，既可增高溶液浓度，避免仪器因溶液浓度过低而无法检出，又可提高样品回收率。

表1 甲基硫菌灵不同前处理对回收率的影响

2.2.3 无水硫酸镁含量和PSA含量确定

为确定样品在进行净化操作时，无水硫酸镁和乙二胺基-N-丙基(PSA)的最佳添加量，设置了不同梯度水平的添加试验，每个梯度水平设计3个重复，以平均值计最终值(表2、表3)。

表2 无水硫酸镁不同添加量对回收率的影响

表3 PSA不同添加量对回收率的影响

由表2可知，随着无水硫酸镁含量增加，芦笋、芦笋植株以及土壤样品的回收率有提高趋势。当无水硫酸镁添加量为180 mg时，回收率最高，为80.9%～ 83.7%。但随着无水硫酸镁的持续增加，样品回收率呈下降趋势，分析其原因可能是由于加入的固体量已经超出了使样品达到最佳盐析状态含量，过多固体影响了振荡、离心、移取等操作，最终导致回收率下降。由表3可知，样品回收率随着PSA含量增加而提高，当PSA添加量达到45 mg以上时，回收率较佳，为81.4%～83.6%，综合试验效果、价格等因素，确定净化操作时，PSA加入量为45 mg。

2.3 检测条件

2.3.1 检测波长确定

通过PDA二极管阵列检测器对甲基硫菌灵进行波长扫描，结果表明，当检测波长为270 nm时，甲基硫菌灵有较好的吸收峰，且不受杂质峰干扰，因此确定本方法的检测波长为270 nm。

2.3.2 流动相配比选择

甲基硫菌灵属苯并咪唑类杀菌剂，检测过程中如果不通过加入离子对试剂、调节pH等方法来优化色谱条件，易出现保留时间过长、峰拖尾或变形等现象。本试验使用甲醇和离子对试剂为流动相，设计了8种不同流动相配比，考察了分析效果(表4)。结果表明，流动相中甲醇含量过低时，出峰及峰分离效果差；当流动相中甲醇比例达70%以上时，出目标峰，但目标峰与杂质峰分离效果不佳。综合目标峰出峰情况、目标峰与杂质峰分离效果等因素，选择流动相甲醇与离子对试剂磷酸-癸烷磺酸钠溶液配比为50∶50 (体积比)。

表4 甲醇和离子对试剂不同配比对目标峰的影响

续表4

2.3.3 柱温和流速选择

分别考察了4个梯度柱温(25、30、35、40 ℃)和3个梯度流速(0.6、0.8、1.0 mL/min)。试验发现，当柱温为25 ℃，流速为0.8 mL/min时，目标峰出峰时间为15.979 min；当柱温升至40 ℃，流速为1.0 mL/min时，出峰时间提前但存在与杂质峰交叉现象，且温度过高也不利于仪器性能和使用寿命。试验确定最佳柱温为25 ℃，流动相流速为0.8 mL/min。

2.3.4 方法最低检出浓度

通过3倍噪音计算可知本方法最低检出量为7.5×10-9g，将相应样本溶液进样体积、样本溶液定容体积等相关数据代入式(1)，求得本方法最低检出浓度为0.01 mg/kg。

2.3.5 方法重复性

将100 mg/L甲基硫菌灵标准储备液稀释成5个不同浓度系列标准品溶液，根据1.2.4节高效液相色谱检测条件进行检测分析。由表5可知，甲基硫菌灵目标峰保留时间的相对标准偏差和峰面积的相对标准偏差分别为0.01%～0.04%和0.93%～3.00%，方法相对误差较小、重复性好，符合农药残留试验要求。

表5 甲基硫菌灵不同浓度标准品出峰时间与对应峰面积

续表5

2.3.6 方法的准确度和精确度

在芦笋、芦笋植株及土壤空白样品中添加0.5、1.0、2.0 mg/kg 3个不同浓度水平的甲基硫菌灵标准溶液，按本试验样品前处理方法和色谱检测条件进行添加回收试验。结果表明，添加浓度为0.5～2.0 mg/kg时，甲基硫菌灵在芦笋中的平均回收率为73.12%～ 83.55%，相对标准偏差为2.68%～3.98%，在栽培土壤中的平均回收率为75.53%～85.68%，相对标准偏差为1.46%～3.75% (表6)。

表6 甲基硫菌灵在芦笋、芦笋植株和土壤中的添加 回收率及相对标准偏差

3 结 论

结合QuEchERS[10]方法，重点对样品前处理中提取溶剂、净化物质的最佳添加量等进行了考察分析，对高效液相色谱检测条件中检测波长、色谱柱温和流速以及流动相最佳配比等色谱条件进行了优化，建立了芦笋及其栽培土壤中甲基硫菌灵残留分析方法，即PSA分散固相萃取和离子对高效液相色谱法。与气相色谱法相比，该方法具有灵敏度高，分离效能好、检测速度快等优势。添加回收试验验证了该方法的精确度和准确度均符合农药残留分析与检测技术要求，方法具有重复性好、样品前处理操作简单省时等特点，可用于检测芦笋及其栽培土壤中甲基硫菌灵的残留量，为其田间残留消解动态研究提供了指导。