中国白酒氨基甲酸乙酯形成的代谢机制及控制技术研究进展

唐云容，杨军林

（贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司，贵州习水 564622）

白酒作为我国一种技艺传承上千年的蒸馏酒，其自然接种、长时间、开放式的固态发酵方式，造就了不同于西方蒸馏酒纯种液态发酵的风格特征。氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）对人类具有潜在的致癌风险，国际癌症研究署已将其划归为2A类致癌物。加拿大于20世纪80年代首次规定以谷物为酿酒原料的蒸馏酒中EC 含量≤150µg/L，随后欧美等国亦规定了EC 的限量，但我国尚未制定白酒中EC 的限量标准。近年来世界多地多种发酵食品及饮料酒中均检出不同浓度的EC。因此，各国食品安全及与人类健康相关的研究机构开展了针对酒中EC 的限量标准的制定和风险评估，积极探索和寻找降低或消除EC含量的控制措施。

国内外科研人员开展了EC 在白酒发酵、蒸馏及贮存过程中的代谢机制研究，以明晰EC 的生成途径，为控制EC 含量提出具有实践性的相关措施。充分认识我国白酒中EC 含量分布、风险暴露情况，有助于为制定其限量标准提供数据支撑。当前，研究人员通过物理化学、酶学及代谢工程等技术手段对我国白酒发酵、蒸馏及贮存过程中EC 含量的控制措施进行了大量研究工作。鉴于我国白酒尚未建立EC限量标准，深入开展白酒中EC形成的代谢机制、控制措施、风险评估等方面研究对保障消费者身体健康具有重要现实意义，进而能有效保障我国白酒企业的良性发展及白酒产品的质量安全。

1 白酒中EC形成的代谢机制研究

目前，国外对蒸馏酒中EC 的形成途径已有较多研究，国内对EC 的研究主要集中于黄酒、葡萄酒。国内外针对我国白酒中EC代谢机制研究较少，主要涉及白酒中EC 及其前体物质检测方法的开发，酒醅和窖泥中微生物谱系图的构建，以及分离筛选或利用基因工程手段改造具有生成EC 水解酶的优势菌株等方面。某些以单一菌株为生产菌株的发酵产品，其EC的形成机制已比较清楚，如黄酒中的EC 主要为酵母或乳酸菌代谢产生的尿素、瓜氨酸和乙醇在煎酒和储存过程生成。以复杂混菌为发酵主体的发酵过程，如白酒发酵过程中EC 的形成机制尚不清楚。因此，要控制和减少白酒发酵过程中形成的EC，需先阐释EC 的代谢机制，找寻与EC 形成相关的关键物质代谢途径以及环境调控因素。

1.1 白酒固态发酵过程中EC形成的代谢机制

目前，在白酒固态发酵过程中形成EC 的代谢机制以及其前体物质并不十分清楚。现有研究表明，我国白酒在固态发酵过程中生成EC 途径可能与发酵酒的发酵过程相类似，梁晨分析了芝麻香型白酒与酱香型白酒在发酵过程中EC 与尿素含量变化情况，发现尿素与EC含量变化显著相关，而瓜氨酸含量变化与EC 变化不显著，指出尿素是两种香型白酒中EC 形成的主要前体物质。除发酵过程中EC前体物质的含量会影响最终EC的含量外，发酵过程中的温度、pH 值和乙醇的含量都会影响EC 的形成。李拥军等以浓香型和芝麻香型白酒为例，探究发现酒醅固态发酵过程中EC 积累量远高于发酵初期，低pH 值酒醅有利于EC 的形成。芝麻香型酒醅EC 主要积累期为发酵2～4 周，占发酵周期EC 形成的83.02 %，浓香型酒醅EC 主要积累于发酵后期。发酵温度对EC 形成速率影响极大，控制发酵温度是关键因素之一。

此外，瓜氨酸及尿素的形成在很大程度上与发酵微生物有关，酿酒酵母能够将精氨酸大量转化成尿素，具有精氨酸脱亚氨基（ADI）途径的细菌则能代谢精氨酸形成瓜氨酸。瓜氨酸作为非蛋白质氨基酸，通过细菌代谢精氨酸途径以控制瓜氨酸的积累，进而控制EC生成。针对我国白酒固态发酵过程中EC 前体物质的有效确认是关乎EC 含量控制的重要举措之一，结合新型科研手段开展白酒固态发酵过程中EC 前体物质的研究成为今后的热点及重点方向之一。

1.2 我国白酒蒸馏过程中EC 形成的代谢机制

我国白酒在蒸馏过程中温度可达100 ℃，但EC 的沸点达184 ℃，仅有少量酒醅中EC 经蒸汽流入基酒中，据预测白酒中80%的EC 在蒸馏过程中和蒸馏后48 h 内产生。瓜氨酸因沸点低于尿素，在白酒蒸馏过程中对EC 含量的影响较大。酿酒原料中的生氰糖苷在发酵过程中经β-葡萄糖苷酶水解或者高温酸解会产生氰醇，在碱性条件或者加热60 ℃左右会分解产生氰化物，在蒸馏过程中大量无机氰化物生成氰酸盐，与乙醇反应生成EC。张温清研究发现白酒蒸馏过程中不同馏分EC 含量相对较低，且面糟发酵层酒醅馏分中EC 含量高于中糟及底糟层，同时，面糟和中糟层馏分中EC 含量呈下降趋势；张庄英发现白酒在蒸馏前期EC 来源为酒醅中原有的EC，蒸馏后期为前体物质与乙醇反应生成，且氰化物为EC 的主要前体物质。我国白酒生产工艺沿袭古法，应研究如何在保证酒体风味不变的情况下，适宜调整白酒蒸馏过程的操作工艺，以降低白酒中EC的生成。

1.3 我国白酒贮存过程中EC形成的代谢机制

据报道，黄酒和葡萄酒中EC 生成的速度随着贮存温度的升高而加快，白酒的贮存温度亦是影响EC含量的因素之一。由于白酒“越酿越香”，贮存时间长短亦是影响EC 含量多少的原因之一。仇钰莹研究发现贮存不同年限的浓香型基酒中EC含量增加与尿素和瓜氨酸含量降低呈相关性变化，通过模拟试验证实尿素与瓜氨酸为主要前体物质，氰化物对EC 生成作用甚微，这可能与酿酒原料的不同导致引入氰化物含量较低有关，Fang 等亦证实了尿素是基酒贮存期间EC 生产的主要前体物；张庄英研究发现白酒的贮存时间会影响EC 及其可能前体的含量，经线性拟合和双变量相关分析，氰化物是白酒贮存过程中生成EC的主要前体，瓜氨酸也与此阶段EC 的生成有一定关系，但尿素不是白酒贮存过程EC 生成的主要前体，这与前面结论有所不同；王金龙等发现贮存容器、光照和温度是影响EC 含量的重要因素，陶制容器于低温避光条件下贮存基酒有利于EC 含量的控制，贮存温度亦是短期内影响基酒中EC 含量变化较大的原因。结合前人研究结论，发现我国白酒贮存过程中EC 的前体物质主要分为尿素和氰化物两大类，前期结论的不统一性造成了消除EC 的措施实施困难较大，后期可开展全面解析我国白酒贮存过程中EC来源，为制定合理的控制措施提供思路。

2 白酒中EC控制技术研究

我国白酒中EC 的存在影响消费者身体健康及造成食品安全风险，因此亟需寻找有效降低EC 含量的控制措施。目前研究人员针对EC 的主要来源和形成途径开发了多种饮料酒中EC 含量的控制措施，包括酿酒原料的选择，生产工艺控制，发酵菌种的选育及改良或在基酒中直接消除。此外，在白酒中EC含量控制技术研究方面，通过控制合成EC的前体物质的含量，亦可有效减少白酒EC含量。

2.1 酶法降解

酶法降解作为从终端消除EC 的方法，不受前体物质种类限制，对于解决发酵食品中EC所造成的食品安全问题具有重要的研究意义。通过添加EC水解酶（Urethanase）将EC 水解成乙醇、NH和CO。国内外研究者从sp.、sp.、sp.等菌株中分离出EC 水解酶。产EC 水解酶菌株所得酶活力低，且水解EC 的效果因酒种类的不同具有较大差异，故对EC 水解酶的研究仍需加强，加之我国白酒有酸性、乙醇高的特点，对其耐酸性和耐乙醇性提出了更高的要求。因此，仍没有可有效降解白酒中EC 的水解酶。张素芳等从土壤中筛选得到1 株可高效降解EC 的根瘤土壤杆菌，对EC 的降解率达到95 %，对发酵食品尤其是酒类食品中EC 有很好的降解能力，可有效提升白酒、葡萄酒、清酒、黄酒和米酒等发酵食品的品质安全；陈启和等利用酒酒球菌可产EC水解酶的能力，降解黄酒在发酵过程中生成的EC，达到有效降解EC 含量的目的；周雪燕等以体积分数5%的戊二醛溶液与壳聚糖交联8 h 制备的载体对EC 水解酶粗酶液进行固定化，该固定化酶的乙醇耐受范围广，催化活性高，EC 去除率达30.90 %，是游离酶的81.53 %，且固定化酶对挥发性风味物质的不利影响远低于游离酶；刘晓慧研究获得了满足工业应用条件的EC 水解酶，通过筛选微生物来源的EC 水解酶，选择应用特性较好的进行分子改造，提高了耐酸、耐乙醇和底物亲和力等方面的应用特性。

酸性脲酶（Urease）作为一种降解尿素以生成CO、水和NH的有效酶，通过降解发酵过程中产生的尿素，间接控制EC含量。当前，有多种产酸性脲酶的菌株被分离筛选，可有效降低尿素含量。方芳等通过将罗伊氏乳杆菌或其粗酶液添加到出窖酒醅中，可降低酒醅中尿素含量，进而减少酒体中EC 含量，达39.1%。脲酶虽已实验应用于黄酒，葡萄酒和清酒，但因脲酶价格昂贵，故投入到酒企工业化生产的酸性脲酶仍未见报道，将其应用到白酒生产中以控制EC含量且对白酒风味影响较小的脲酶的研究较少。Carreti 等研究人员从发酵乳杆菌）中提取纯化酸性脲酶对6款意大利生产的葡萄酒进行了酶法处理并分析EC含量变化，尿素水解成功地降低了EC前体物含量，降低了葡萄酒中的EC 含量；刘庆涛鉴定出来源于ATCC 9945A 的脲酶（BpUrease）为含Fe 的酸性脲酶且能降解EC，通过分子改造的手段强化BpUrease 对黄酒中EC 的降解能力，最终提高BpUrease 在食品级表达系统TEA/pTTB 中的表达量，为BpUrease的工业化应用打下基础；Jia 等通过SCO2 编码脲酶基因，在中成功表达脲酶，并优化培养基配方、温度和异丙基硫代-β-D-半乳糖苷浓度诱导脲酶的表达，使其表达量提高到14.7 U/mL，SCO2脲酶对黄酒中的EC具有较好的降解能力，其降解率为14.7 %；Masaki 等研究了AmdS 编码的乙酰胺酶可能有催化降解EC 的能力，经纯化的AmdS 被鉴定为由4 个60 kDa单元组成的同型四聚体，具有脲酶活性，AmdS 在0 %～40 %乙醇溶液中稳定、最佳温度为40 ℃、pH6.4～9.6 时表现出脲酶活性且pH9.6 时活性最高，可作为降解EC 的候选酶类之一；查小红采用载体固定化和无载体固定化两种方式对酸性脲酶进行固定化，发现交联脲酶聚集体（crosslinked urease aggregates，CLUAs）对尿素的去除率较高，达85 %以上，在分批搅拌-膜分离式反应器中，CLUAs 对黄酒中EC 的去除率高达46%，且对产品风味无影响。

目前，已报道筛选出的酶类主要存在对乙醇的耐受性较差、底物特异性及对底物的亲和力较差。因此，获得稳定性好和底物亲和力高的高效酶类是实现其白酒工业化应用的重要前提。

2.2 微生物法

酿酒酵母在精氨酸代谢途径中代谢精氨酸产生尿素，未被分解的尿素会被分泌到胞外，导致尿素的累积。20 世纪90 年代末期科研人员曾筛选出一株精氨酸酶缺陷型酵母菌株，并用于日本清酒发酵模拟试验，发酵液中无EC 存在。选育低产尿素酵母菌的方法仅适用于纯种发酵或以酵母菌为主的发酵过程，我国白酒窖内发酵多为混菌种发酵，对某一菌株的改造无法实现对其中EC 及其前体物质积累的有效控制。江南大学研究人员通过从大曲及酒醅中筛选可降解EC 及其前体物质的内源性菌株，对尿素或EC 具有降解活性，可实现对白酒中EC 及其前体物质的有效减控；Wu 等利用改进的CRISPR/Cas9 系统，在之前修饰过的菌株中表达DUR3 基因，对菌株进行代谢改造，从而进一步降低EC 水平，与N85 原菌株相比，EC 浓度降低了58.5 %，在重复酿造试验中，该工程菌株在降低尿素含量方面表现出良好的遗传稳定性。基因操作对酵母菌株的生长和发酵特性的影响较小，因此，构建的菌株在黄酒生产过程中具有降低尿素和EC 含量的潜在应用价值。此外，通过位点饱和诱变提高了urease（Bp Urease）的EC降解能力，实验表明L253P/L287N菌株能有效降解模型米酒中的尿素和EC，该技术具有良好的食品工业实际应用前景。Guo 等从二倍体葡萄酒酵母WY1 中通过连续缺失两个CAR1等位基因来阻断尿素产生途径，通过构建精氨酸酶缺陷重组菌株YZ22，使EC 含量降低了73.78 %；Cui 等利用MT33 在白酒发酵过程中进行降解EC 及尿素的研究，白酒发酵接种赖氨酸芽孢杆菌，其最大相对丰度从0.02%提高到8.46 %，最终EC 和尿素含量分别降低了41.77 %和28.15 %，EC 在白酒中的浓度降低了63.32 %；Wang 等通过从大曲中分离筛选出酿酒酵母菌株（）并在一系列胁迫条件下进行模拟发酵实验，在发酵温度低于25 ℃、pH4.0、乙醇浓度4 %vol～6 %vol 以及一定的初始盐浓度条件下可通过降低精氨酸酶的转录水平和提高尿素羧化酶的转录水平以降低精氨酸的消耗和尿素的产生，最终导致EC含量的降低，该措施将有助于改进我国白酒中EC 含量的控制策略。通过基因工程手段改造酵母菌以降低其在窖内发酵过程中产尿素及其他前体物质的能力，对于控制我国白酒中EC 含量和提高其食品安全性具有重要的研究意义。

2.3 优化生产工艺

优化白酒企业生产工艺，同样可减少白酒中EC含量。我国白酒酿酒原料在发酵过程为EC 的形成提供了重要的前体物质，通过筛选其含量较低的酿酒原料，可以降低发酵过程中EC前体物质含量，进而减少EC的形成。有研究人员发现避光贮存、控制贮存温度以及缩短贮存时间可有效降低葡萄酒贮存过程中EC的产生；通过酒尾的分离举措以及使用低温蒸馏及高回流率等方式亦可实现其中EC 含量。此外，研究发现EC 的合成受pH 值、O、贮存条件等的影响。王霈虹等通过优化黄酒生产工艺中煎酒和灭菌的温度，达到控制EC 含量的目的；黄庭明采用低温陈酿方式降低了黄酒中EC 含量。蒸馏过程中使用铜制器皿，因催化剂作用导致其中EC 含量的增加，故通过优化生产工艺，可有效减少EC 含量。我国白酒因独特生产工艺产生特殊香气，若采用优化白酒生产工艺的策略，可能很难保证酒体品质。因此，通过优化生产工艺以降低EC 含量能否应用到白酒实际生产过程中仍需全面深入研究考察。

2.4 二次蒸馏法

目前，世界上蒸馏酒多数采用二次或二次以上的液态壶式蒸馏方式，威士忌和甘蔗朗姆酒采用二次蒸馏方式能降低EC 含量。吴晨岑等发现浓香型基酒经壶式、常压或减压蒸馏过程后，二次蒸馏方式可有效降低EC 含量，其总酸、总酯浓度降低，感官品质提升，酒体风格依旧；Alcarde等研究了利用二次蒸馏手段降低甘蔗酒中EC 的含量，研究表明，通过二次蒸馏可显著降低甘蔗酒中EC 含量，在第二次蒸馏过程中，生成的EC 约97 %可从甘蔗酒中除去。二次蒸馏方式消除白酒中EC 含量具有一定的潜在价值，在保证酒体风味的同时考虑设计二次蒸馏设备用于实际生产过程中，可消除我国白酒中EC含量对消费者造成的潜在健康危害。

2.5 NCR调节

在白酒发酵过程中，尿素可被微生物利用分解为NH、CO，氮分解代谢产物抑制（Nitrogen Catabolite Repression，NCR）途径会影响微生物对尿素的利用，导致其在细胞中积累后释放到胞外，参与EC 的生成。其中，酵母作为产生尿素的主要菌株，如酱香型白酒的酿酒酵母（）、清香型白酒的异常威克汉逊酵母（）等。通过抑制NCR 正调控因子核定位信号的中磷酸化和负调控因子Ure2p基因的表达，可使优质氮源对酵母中DUR1，2 和DUR3 的表达抑制降至最低，进而减少尿素被释放到胞外参与生产EC 的可能。Zhao 等通过突变酿酒酵母中核定位信号（Nuclear Location Sequence，NLS）的磷酸化位点并敲除Ure2p基因，使酿酒酵母中DUR1，2 和DUR3 的表达得以激活。研究人员通过调控白酒中酿酒微生物的NCR 环节，增强微生物有效利用尿素的可能，降低胞内尿素释放至胞外参与EC的生成，进而减少白酒中EC生成。

2.6 直接去除法

除上述降低白酒中EC 含量的措施外，还可以通过利用阴离子交换柱、吸附剂与超声、微波协同措施以去除EC 及其前体物质，以及添加焦亚硫酸钾、二乙基二硫代氨基甲酸钠降低EC 含量等。陈启和等在黄酒发酵过程中添加没食子酸（或原儿茶酸，或竹叶提取物），可有效抑制瓜氨酸及尿素转化生成EC；周凯等在发酵前加入芦丁和（或）槲皮素与没食子酸实现同时降低发酵食品中瓜氨酸和EC 累积，EC 降低量最高为64.7 %，并且对产品品质影响较小。此外，亦有研究人员指出，可通过控制施肥，调节原料的营养成分以达到减少EC 的目的。总之，上述方法具有一定减少EC含量的效果，且操作简单易于工业化应用，但添加外源性物质可能造成产品风味的改变，且抑制效果在应用中并非理想。因此，仅将其作为降低EC 含量的辅助手段。

目前，我国白酒生产过程多采用天然混菌种固体发酵工艺，上述直除方法可应用于单菌种液体发酵体系的发酵及贮存过程和成品酒中EC 含量的控制，不太适用于白酒生产过程中EC含量的控制。

3 白酒中EC污染分布及风险评估

迄今为止，我国白酒香型种类众多，不同香型白酒中EC 污染存在较大的水平差异。因消费水平的地域差异，造成对饮酒者健康的威胁要高于其他人，故应将白酒中EC 作为风险评估重点。Jung等采用暴露边界比（Margin of Exposure，MOE）法和致癌风险评估对韩国酒精饮料中EC 含量进行风险评价，依据性别和年龄分组发现韩国饮酒成年人每日饮用酒精饮料为184.2～237.1g/d，在145 种酒精饮料中，韩国烧酒和啤酒对饮酒人群EC 暴露的贡献值最大，韩国平均饮酒者MOE 和致癌风险值分别为14874 和1.01×10，95 %饮酒者的MOE 和致癌风险分别为2951和5.08×10；张顺荣等以10种香型白酒基酒和成品酒中EC 含量为数据来源，占比近一半的成品酒样品EC含量超过了150µg/L，结合MOE 法对成品酒中EC 风险进行评估发现具有较大的健康风险；彭小东等发现326 份酱香成品酒中有十分之一样品的EC含量超出了150µg/L，利用MOE法判定其EC的健康风险较小。

白酒作为我国传统蒸馏酒受到消费者广泛喜爱，EC 含量的健康风险情况备受关注。我国白酒因生产过程中可能有其他已知或未知的健康风险物质，单纯的数据统计不能排除EC 和其他对人体有害物质间交互作用，故仅仅通过MOE 法评估白酒中EC 的健康风险有所不足。鉴于我国白酒中的EC 暴露风险高于国内其他饮料酒类，需要在降低消费的同时发展更严格的监管来规范白酒中EC 水平。因此，亟需制定我国白酒中EC的限量标准，采取针对性的控制措施以降低白酒中EC含量。

4 总结与展望

目前，EC 作为白酒固态发酵、蒸馏及贮存过程中产生的主要内源性污染物之一，我国白酒中EC控制措施的研究还相对较少，因此深入研究白酒在发酵、蒸馏及蒸馏后贮存过程中EC 的主要前体物质，主要形成途径，以及关键作用微生物，对于白酒中EC含量的控制有重要意义；开展白酒中EC含量控制的相关措施研究有助于降低生产风险并推动产业化应用，为我国白酒企业食品安全的有序良性发展提供重要的商业价值。因此，我国白酒中EC的相关研究可着重于以下两个方向：一方面是尽快推进建立我国白酒中EC 含量的限量标准，这可为白酒企业产品食品安全提供指导依据，同时，加快白酒中EC 形成的代谢机制系统性研究，提出切实可行的EC 控制措施应用于实际生产，促进白酒产业的良性可持续发展；另一方面是逐步完善白酒中EC 风险评估方法，通过探究EC 和其他有害物质间的交互作用，实现更加科学可靠的风险评估。