载脂蛋白Eε4基因型对阿尔茨海默病患者脑血流的影响分析

郭启雯， 陈淳淳， 许春燕， 邱国真， 朱飞奇

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一种起病隐匿的神经变性病变，也是老年性痴呆最常见的类型之一。“β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)假说”是多年来被广泛接受的AD发病机制之一[1]。但近年也有越来越多的研究发现，脑血流灌注(cerebral blood flow perfusion，CBF)降低是认知功能障碍发生、发展的基础[2-7]。载脂蛋白E(apolipoprotein E，APOE)ε4基因型是公认的AD遗传危险因素，与早发性和晚发性AD的发生、发展风险呈正关联[8]，且与CBF降低相关[9-10]。经颅多普勒超声(transcranial Doppler sonography，TCD)是一种临床常用的非侵入性、可简便评估颅内血流灌注的方法。本研究应用TCD检测患者颅内动脉的血流动力学变化，分析其与认知功能损害的相关性，并探讨APOEε4基因型对AD患者血流动力学变化的影响。现报道如下。

1 对象与方法

1.1研究对象 选择2020年4月至2021年4月深圳市罗湖区人民医院神经内科收治的AD患者31例为观察组；另选择同期认知功能正常的健康老年者25名为对照组。观察组简明精神状态量表(Mini-mental State Examination,MMSE)评分低于对照组，两组年龄、性别、合并症等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组一般资料比较

1.2纳入与排除标准 观察组纳入标准：(1)完善MMSE认知功能评估和头颅MRI+磁共振血管成像(magnetic resonance angiography,MRA)检查，符合美国神经病学、语言障碍及梗死-老年性痴呆和相关疾病学会(National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke-Alzheimer′s Disease and Related Disorders Association，NINCDS-ADRDA)可能为AD和(或)很可能为AD的诊断标准[11]；(2)MMSE评分为3～24分(根据文化程度不同，评分不同)[12]；(3)年龄60～90岁。对照组纳入标准：(1)无认知障碍主诉，MMSE评分>27分；(2)年龄60～90岁。排除标准：(1)合并其他非AD类型痴呆；(2)正常颅压脑积水、颅内占位病变、甲状腺功能低下、抑郁症、脑炎等所致的痴呆；(3)有吸毒史；(4)有精神病史；(5)有冠心病、心衰、房颤、颅内外动脉狭窄、脑血管病等病史。

1.3评分和检测方法

1.3.1 MMSE评分[12]MMSE量表内容共包含30项，每项回答正确得1分，总分30分。认知功能障碍的评判标准：文盲者，≤17分；受教育年限≤6年者，≤20分，受教育年限≥7年者，≤24分。

1.3.2 TCD检测方法 应用深圳德力凯公司生产的EMS-9PB经颅多普勒脑血管诊断/监护系统，采用2 MHz脉冲Doppler探头，由专人完成检查。经患者颞窗、枕窗探查患者双侧大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)、大脑前动脉(anterior cerebral artery,ACA)、大脑后动脉(posterior cerebral artery,PCA)、基底动脉(basilar artery,BA)和椎动脉(vertebral artery,VA)，获得平均血流指数(mean blood flow velocity，MFV)及搏动指数(pulsatility index，PI)。

1.3.3 APOE基因型检测 检测由医院检验科完成。抽取研究对象静脉血2 ml，采用赛乐奇生物科技有限公司(珠海)生产的血液核酸提取试剂盒提取DNA。应用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)进行扩增，反应条件设置为：95 ℃预变性15 min，94℃变性30 s，50 ℃退火2 min，65 ℃延伸45 s，共45个循环。将qRT-PCR扩增产物99 ℃加热5 min，冰浴5 min，与基因芯片上特异性核酸探针进行杂交，测定APOE基因位点序列。基因芯片购自赛乐奇生物科技有限公司(珠海)。

2 结果

2.1两组颅内动脉的MFV比较 观察组双侧MCA、ACA、PCA、VA及BA的MFV均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组颅内动脉的MFV比较

2.2两组颅内动脉的PI比较 观察组双侧MCA、ACA、PCA、VA，以及BA的PI均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 两组颅内动脉的PI比较

2.3AD患者MMSE评分与颅内动脉血流动力学参数的相关性分析结果 Pearson相关性分析结果显示，AD患者的MMSE评分与双侧MCA、ACA、PCA、VA以及BA的MFV呈正相关(P<0.05)，与其PI呈负相关(P<0.05)。见表4，5。

表4 AD患者MMSE评分与颅内动脉的MFV的相关性分析结果

表5 AD患者MMSE评分与颅内动脉的PI的相关性分析结果

2.4颅内动脉MFV、PI诊断AD的效能分析结果 ROC曲线分析结果显示，双侧MCA、ACA、PCA、VA以及BA的MFV和PI均有诊断AD的应用价值(P<0.05)，各指标的AUC>0.70。见表6。

表6 颅内动脉的MFV、PI诊断AD的效能分析结果

2.5AD患者APOE基因型情况 31例AD患者中有26例患者行APOE基因检测，其中APOEε4型11例(42.31%)(ε4/4型5例，ε3/4型4例，ε2/4型2例)，APOEε2型2例(7.69%)(ε2/2型1例，ε2/3型1例)，APOEε3型13例(50.00%)(均为ε3/3型)。

2.6APOEε4型组和非APOEε4型组的MMSE评分、颅内动脉血流动力学参数的比较 AD患者中，APOEε4型组的MMSE评分较非APOEε4型组低，差异有统计学意义[(19.50±8.62)分 vs (24.15±5.14)分；t=2.322，P=0.030]。APOEε4型组颅内动脉的MFV较非APOEε4型组低，PI较非APOEε4型组高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表7，8。

表7 APOEε4型组和非APOEε4型组颅内动脉MFV的比较

表8 APOEε4型组和非APOEε4型组颅内动脉PI的比较

3 讨论

3.1AD是最常见的老年痴呆类型，尽管“Aβ假说”在AD的发病机制中长期处于主导地位，但是近年的研究认为脑血流下降是AD早期的发病机制[2]。Nortley等[13]通过AD患者和AD鼠模型证实，Aβ可诱导脑毛细血管产生活性氧，进而引起内皮素-1(endothelin-1，ET-1)释放，激活周细胞ET-1受体，诱导脑毛细血管收缩，导致脑微循环障碍。Zlokovic[14]的研究提出，AD是继发于中枢神经系统血管功能异常的神经变性疾病，其神经变性是血脑屏障破坏、CBF下降、脑代谢改变等造成的结果。不少研究也表明，CBF下降可引起脑细胞代谢降低、神经细胞凋亡等，导致Aβ沉积，以致神经元功能障碍，提示CBF降低是AD发生、发展的基础[2-7]。本研究通过TCD检测发现，AD患者的双侧MCA、ACA、PCA、VA及BA的MFV降低，PI增高，提示AD患者存在CBF降低和血管顺应性下降的情况。MMSE量表在临床上常用于认知功能的筛查[12]。本研究结果显示，AD患者颅内动脉的MFV与MMSE评分呈正相关，其PI与MMSE评分呈负相关，提示AD患者的脑血流动力学异常程度与认知功能损害程度存在相关性，即患者认知损害程度越严重，其颅内动脉的平均血流速度降低越明显，血管顺应性越差，这与国内相关研究[15]结果相似。这也表明AD患者的脑血流动力学改变会广泛累及颅底动脉环(Willis环)的动脉段，当AD患者出现CBF下降时将无法通过侧支循环代偿，引起脑部缺血、缺氧进一步加重，导致认知障碍进展。提示AD患者早期发现CBF降低时应尽早干预，如给予血管活性药物改善脑血流灌注，减缓AD的进展[16]。本研究结果显示，双侧MCA、ACA、PCA、VA以及BA的MFV和PI均有诊断AD的应用价值，且AUC均>0.70，所得MFV、PI截断值有助于早期筛选AD患者。

3.2APOEε4基因型是散发型AD发病的重要风险基因之一，与早发性和晚发性AD的发生风险呈正关联[8]。有研究发现，APOEε4可能通过激活周细胞附近及内皮细胞中的亲环蛋白A-基质金属蛋白酶-9(cyclophilin A-matrix metalloproteinase-9，CypA-MMP9)通道，引起血脑屏障的渗漏，进而导致认知功能下降[17-18]。Sagare等[19]在Aβ沉积小鼠模型中发现，APOEε4会干扰周细胞以APOE异构体依赖性方式摄取Aβ，导致脑淀粉样血管病和Aβ斑块负荷增加。Blanchard等[20]的体内研究发现，APOEε4型基因携带者周细胞的APOE mRNA和蛋白质表达水平更高，导致Aβ在血管内沉积增加，暴露在Aβ寡聚体中的周细胞通过激活ET-1受体使毛细血管收缩，进而导致脑血流量减少[13]。Yamazaki等[21]的研究发现血管壁细胞的APOEε4表达减少了脑微循环的血流量，引起认知功能损害。有研究发现，携带APOEε4基因型的AD患者多个脑区的CBF明显降低，且会引起患者语言、记忆等认知功能下降[9-10]。Ungar等[22]的研究也表明，携带APOEε4基因型的AD患者临床症状更重、病程进展更快。上述研究提示，APOEε4基因型是导致AD的脑血流改变及认知功能障碍的危险因素。本研究也发现，APOEε4型组颅内动脉的MFV较非APOEε4型组低，PI较非APOEε4型组高，且MMSE评分更低，提示AD患者脑血流调节功能下降及认知障碍与APOEε4基因型有关，这与上述研究结论相符。本研究中携带APOEε4基因型的AD患者存在广泛的颅内动脉血流动力学改变，这与Wierenga等[10]研究发现携带APOEε4基因型的轻度认知功能障碍患者仅局部脑区的CBF降低的结果有所差异，分析其原因可能是携带APOEε4基因型的轻度认知功能障碍患者仍有较多脑内侧支循环代偿以维持认知功能，而携带APOEε4基因型的AD患者已逐渐失代偿。

综上所述，AD患者存在以MFV降低、PI升高为主要脑血流动力学改变的特点，且脑血流动力学变化与AD患者认知功能损害程度相关。携带APOEε4基因型可导致更显著的CBF下降以及更严重的认知功能损害。但本研究样本量较少，需加大样本量并联合其他辅助检测方法及指标进一步验证。