唐 娜 王子嘉 杨瑞华 于 涛 *
(1.东北林业大学生命科学学院,黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江省农业科学院园艺分院,黑龙江 哈尔滨 150069)
肠道黏膜炎(Intestinal mucositis,IM)是癌症化疗时常见的不良反应之一,会限制其化疗药物的使用剂量。化疗药物引发DNA 和非DNA 损伤,DNA 链断裂直接导致基底上皮细胞和黏膜下层细胞的损伤,同时生成活性氧调控下游信号通路诱发炎症反应,最终导致黏膜破坏。
5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5FU)是临床中治疗恶性肿瘤最常用的化疗药物之一,是胸苷酸合成酶抑制药。临床研究表明,大约60%~80%接受5FU 治疗的患者会出现不同程度的肠道粘膜炎,并导致腹痛、腹泻以及呕吐。因此,能在5FU 治疗过程中降低炎症水平势必会提升整体治疗效果。本研究旨在利用5FU 诱导建立肠道粘膜炎动物模型,这一肠道粘膜炎动物模型可为筛选不影响5FU 疗效并能减弱肠道炎症的药物提供有效技术工具。
SPF 级雄性ICR 小鼠购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司,动物许可证号:SCXK(吉)-2020-0002。5-氟尿嘧啶(CAS:51-21-8,纯度98%),购买于上海笛柏生物科技有限公司;血细胞分析用溶血剂、血细胞分析用稀释液、多酶清洁液购于济南汉方医疗器械有限公司。
KX41 型光学倒置显微镜由日本OLYMPUS 公司生产;HF-3800 型全自动血细胞分析仪由济南汉方医疗器械有限公司生产。
1.2.1 动物分组与造模方法
SPF 级雄性ICR 小鼠(6~8 周龄),体重23~26 g,共20 只,按照体重随机分为2 组:对照组和造模组。对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水,每日1 次,连续5 d;造模组为小鼠腹腔注射5FU(100 mg/kg),每日1 次,连续5 d。
1.2.2 动物一般观察指标
实验期间记录小鼠体重、饮食量、饮水量和大便情况,观察其精神状态,并进行疾病活动指数(Disease activity index,DAI)评分,对动物体重变化比、大便性状和大便便血程度进行综合评分,取3 项的总评分的平均值作为DAI 值,对不同情况进行量化。具体评分细则如表1 所示。
表1 动物疾病活动指数评分表
1.2.3 血液常规指标考察
给药后采集正常组和造膜组的小鼠血液样品,进行白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)和血小板计数(PLT),以及血红蛋白浓度(HGB)的血常规测定。
1.2.4 动物组织收集与病理学观察
末次给药24 h 后处死小鼠,在近盲肠端空肠区域1~2 cm 处截取2 cm,用生理盐水浸泡保持湿润,放入4%多聚甲醛固定,制片后显微镜镜检,进行形态学评价。
1.2.5 统计学方法
本试验曲线的绘制采用应用Graphpad Prism 7.04和Excel 软件进行作图分析,数据均以平均值、标准差(Mean±SD)形式表示。差异性分析采用Unpaired t test进行分析。
如图1 所示,正常组小鼠体重稳定增长,饮水饮食正常,活动敏捷,毛发光滑,无腹泻情况。造模组小鼠则出现饮食饮水量减少、精神萎靡、反应迟钝、羌毛的情况,腹泻症状严重。与正常组相比,造模组小鼠则在此期间内出现明显体重下降情况,体重下降17.77%。DAI 评分结果表明,造模组在给药第4 d 和第5 d 评分上升,评分为1 分。
图1 造模处理对小鼠体重、食量、饮水量的影响
如图2 所示,与小鼠相比,造模组小鼠的白细胞和血小板明显降低,120 h 的检测结果更为显著。而红细胞和血红蛋白水平正常组与造模组均无明显变化。
图2 正常组与造模组小鼠血常规差异
正常组小鼠肠道黏膜组织结构完整,大肠腺织排列整齐规则,绒毛上皮细胞形态完好,无任何炎症现象。造模组小鼠则损伤严重,出现肠道黏膜组织增生、水肿,绒毛脱落,大肠腺织排列紊乱,隐窝消失,淋巴细胞浸润水肿,炎性渗出,伴随出血现象,部分区域出现液化坏死等症状,如图3 所示。
图3 小肠组织形态的病理改变
通过给予小鼠5FU(100 mg/kg)每日1 次,持续5d 可损伤小鼠的肠道系统,引起肠道黏膜组织损伤,产生炎症和坏死区域,从而导致小鼠饮食饮水量降低,精神萎靡,体重急剧下降诱发腹泻便血。血常规指标也显示,小鼠白细胞和血小板水平变化明显,证实小鼠肠道黏膜炎模型构建成功。