宁夏某肉牛场牛呼吸道疾病综合征相关病原检测及分型鉴定

常益铭，岳华，2，汤承，2

（1.西南民族大学畜牧兽医学院，四川成都 610041；2.青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川成都 610041）

目前，临床上引起牛呼吸道疾病的病原感染形式已由单一感染发展为多种病原混合感染，导致牛呼吸道疾病防治难度加大，使其成为严重阻碍养牛业健康发展的一大难题。

牛呼吸道疾病综合征（bovine respiratory disease complex，BRDC）是由外界环境条件、动物机体和多种病原体相互作用引起的牛呼吸系统疾病统称，具有较高的发病率和死亡率，是世界范围内严重危害养牛业健康发展的重要疾病之一[1]。引起BRDC 的病原种类繁多，主要由牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhoea virus，BVDV）、牛副流感病毒3 型（bovine parainfluenza virustype 3，BPIV-3）、牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis，IBRV）、牛冠状病毒（bovine coronavirus，BCoV）、牛呼吸道合胞体病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV）、牛细小病毒（bovine parvovirus，BPV）以及多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，P.multocida）、溶血性曼氏杆菌（Mannheimiahaemolytica，M.haemolytica）、牛支原体（Mycoplasma bovis，M.bovis）等组成[2-3]。其中，许多病毒，如BVDV和IBRV，能够对牛造成持续性感染，导致感染牛对其他病原易感性增加，在应激条件下，机体抵抗力降低时，不仅感染的病毒会在体内大量繁殖，也会继发感染其他病原，导致感染牛出现严重临床症状[4]。临床上，BRDC 病因复杂，引起的症状也极为相似，很难根据临床症状进行病原判定，必须配合实验室检测。

2022 年3 月冬春换季期间，宁夏某存栏牛3 000 头的某肉牛场暴发BRDC，各种年龄的牛均有发病，表现为发烧、咳嗽、流脓性鼻液、呼吸困难和腹式呼吸等症状，发病率为28%，死亡率为5%，采用抗生素治疗，效果不佳。为确定引发病情的病原，采集样品进行了BRDC 相关病原的实验室检测及分型鉴定，以便采取针对性防治措施。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 待检样品 在该牛场无菌采集12 份病牛鼻腔深部棉拭子，送实验室检测。

1.1.2 主要试剂与仪器 TrizolTMReagent、Prime ScriptTMRT、2×TaqPCR Master Mix、DNA Marker等，购于宝生物工程（大连）股份有限公司；LifeECO 基因扩增仪，购于杭州博日科技有限公司；凝胶成像系统、核酸蛋白电泳仪，购于Bio-Rad 公司；高速离心机，购于Eppendorf 公司。

1.1.3 参考病毒（菌）株 IBRV、BPIV-3、BRSV、BAdV-3、BCoV、BPV、BVDV、P.multocida（Pm）、M.haemolytica（Mh）和M.bovis等阳性核酸，由西南民族大学动物医学实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 样品处理和核酸提取 在鼻腔深部棉拭子样品中，每份加入5 mL 的PBS 溶液吹打混匀，涡旋3 min，10 000 r/min 离心3 min 后取上清液备用；采用TrizolTMReagent 提取样品总RNA 后反转录为cDNA，同时采用酚氯仿法提取样品DNA。

1.2.2 样品检测 参照文献[5-12]报道的PCR和RT-PCR 方法，分别对12 份样品进行IBRV、BPIV-3、BRSV、BAdV-3、BCoV、BPV、BVDV、Mh、Pm和M.bovis核酸检测，将扩增产物经过电泳鉴定后，选取阳性样品送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，引物序列见表1。

1.2.3 病原分型鉴定 由于BCoV 和BAdV-3 仅有1 种血清型和基因型，因此只对Mh 和BAdV-3这两种病原进行分型鉴定。将经PCR 反应鉴定为Mh 阳性的样品，按照文献[13]报道的方法进行血清型鉴定（表2）；将BVDV 5'-UTR 扩增产物经过凝胶电泳鉴定后，送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，构建遗传进化树进行基因分型。

2 结果

2.1 BRDC 相关病原PCR 检测

BRDC 相关病原检测结果显示：12 份鼻拭子样品中，共检出BAdV-3、BCoV、BVDV 和Mh共4 种病原，阳性检出率分别为100%（12/12）、66.67%（8/12）、66.67%（8/12）和100%（12/12），其他病原均无检出；阳性样品扩增产物经测序均确定为特异性扩增（图1），证实该场BRDC 病情由BAdV-3、BCoV、BVDV和Mh等4种病原感染引起。

表1 PCR 检测引物信息

表2 Mh 分型引物信息

图1 阳性样品PCR 检测结果

2.2 病原混合感染统计

样品检测统计结果显示：此次牛场的BRDC病情由BAdV-3、Mh、BCoV 和BVDV 混合感染引起，共有BAdV-3+Mh、BAdV-3+Mh+BVDV、BAdV-3+Mh+BCoV 和BAdV-3+Mh+BCoV+BVDV共4 种不同形式的混合感染组合，其混合感染率分别为16.67%、16.67%、25.00%和41.67%。

2.3 病原分型鉴定

将检测到的Mh 阳性样品，采用分型引物Hypothetical protein、Core-2/I-Branching enzyme和TupA-like ATPgrasp3 进行血清分型，结果仅有Hypothetical protein 扩增（图2），表明该场流行的Mh 为荚膜血清型A1 型菌株；对8 个BVDV阳性样品的5'-UTR 扩增产物测序后，构建遗传进化树进行基因分型，结果所有样品均与1a 亚型毒株聚为一支（图3），表明该场流行的毒株均为BVDV 的1a 亚型。

3 讨论

图2 Mh 分型鉴定结果

图3 BVDV 5'-UTR 基因核苷酸序列进化树

环境与多种病原体的相互作用是BRDC 的主要发病形式。本研究在宁夏某牧场患有BRDC症状的牛深部鼻腔棉拭子样品中检测到了BAdV-3、BVDV、BCoV 和Mh 共4 种病原，其中BAdV-3和Mh 的检出率均为100%，BCoV 和BVDV 的检出率均为66.67%，表明这4 种病原是造成该牛场发生BRDC 的主要病原。12 份样品均存在不同病原组合的混合感染情况，表明该牛场病情较为复杂。冬春换季期间气候不稳定，这为BRDC 的发生创造了有利条件，同时多种病原的混合感染又增加了病情的严重程度，使得死亡率上升，也给BRDC诊断与治疗带来了阻碍[14]。因此，当天气突变、断奶和运输等应激因素发生时，应做好牛群的抗应激处理。同时要坚持自繁自养，定期检测牛群中BRDC 相关病原的抗体水平[15-16]，以有效预防BRDC 发生；发病时，应尽早进行病原检测，以便采取针对性措施，有效控制病情。

一般认为，病毒对机体的持续感染和免疫抑制是造成BRDC 发生的主要诱因。本研究在12 份患有BRDC 的牛深部鼻腔棉拭子样品中共检测到BVDV、BCoV 和BAdV-3 等3种病毒，证实了BRDC 多病原混合感染的复杂性。BVDV 是黄病毒科瘟病毒属成员，1946 年于美国被首次分离到，最初发现其主要引起消化系统疾病，因此将其命名为BVDV，随后发现BVDV 还可以损伤呼吸、生殖和免疫系统，最主要的危害是引起牛的免疫抑制和持续性感染[17-18]。BVDV 常作为原发病原，与细菌、支原体等其他病原造成混合感染，对世界养牛业造成了无法估量的损失，因此世界动物卫生组织（WOAH）将其列入须通报动物疫病名录。BCoV被认为是引起犊牛腹泻和成年牛冬痢以及各年龄段牛呼吸道疾病的重要病原，主要通过粪-口传播或吸入含有病毒颗粒的气溶胶而造成感染，对于其最初的入侵门户目前仍然存在较大争议[19]。BCoV 除对牛易感外，对长颈鹿、骆驼等多种动物也均具有易感性，甚至对人也有易感性，因而具有重要的公共卫生学意义[20-22]。之前常认为，引起BRDC 的病毒性病原主要有BVDV、IBRV、BPIV-3、BRSV和BCoV 等，但最近研究[23-24]发现，BAdV-3 在患有BRDC 的牛群中广泛存在，并且与BRDC 的发生具有显著的相关性（P＜0.000 1）。本课题组前期在11 个发生BRDC 的肉牛引种场中检测到的BAdV-3 阳性率为78.7%，成功分离到1株fiber基因缺失毒株（BO/YB24/17/CH），并且证实该毒株在我国具有广泛的地域分布[25]。而本研究在12 份BRDC 发病牛的深部鼻腔棉拭子中检测到BAdV-3的阳性率为100%，更加证实了之前的检测结果，表明BAdV-3 也是引起BRDC 的重要病原，应当对该病毒引起足够的重视。

细菌性病原体在BRDC 中的作用常表现为继发感染。细菌性病原虽然不是BRDC 的原发性病原，但当它与其他原发性呼吸道病原混合感染时，则会导致感染动物严重的临床症状，致使其死亡率上升[26]。因此，当发生BRDC 时应当重视细菌感染的防治，及时确定细菌类型，采用敏感类抗生素，尽可能减少损失。本研究在12 个牛深部鼻腔棉拭子中检测到的Mh 阳性率为100%，证实其是造成此次呼吸道疾病的主要细菌性病原。Mh 常作为共生菌分布于正常的牛上呼吸道中，当机体受到应激、病毒感染等原因造成机体抵抗力下降时，会在上呼吸道大量增殖，并侵入下呼吸道，引起较为严重的肺炎[27]。Mh 共有12 个血清型，其中A1、A2 和A6 是流行较为广泛的血清型[28]，而A1 和A6 是引起牛肺炎的主要血清型。A2 血清型常存在于健康牛的上呼吸道，当机体受到外界应激或混合感染时，A2 血清型会迅速被A1 血清型所取代。而本研究在12 份深部鼻腔棉拭子样本中检测到的Mh 阳性率为100%，并且均为A1 血清型菌株，证实该牛场Mh 的优势血清型是A1 型。抗生素是治疗细菌性疾病最有效的方法。近年来，随着抗生素的不科学使用，关于细菌耐药性的报道也越来越多。本案例中，肉牛场曾使用抗生素进行治疗，但治疗效果不佳，表明Mh 对于该牧场所使用的抗生素可能存在耐药情况，因此有必要进行细菌分离和药敏试验，选取敏感抗生素进行治疗。

根据该牛场发病牛的临床症状和实验室检测结果，最终确定该肉牛场发生的BRDC 由BVDV 1a 亚型、Mh A1 血清型以及BAdV-3、BCoV 混合感染引起。鉴于目前BRDC 由多种病原混合感染引起，加强牛场生物安全管理，减少牛群应激，给予良好的生长环境和制定合理免疫程序等综合防控措施，仍然是防制BRDC 最有效的手段。