急性脑梗死患者外周血单核细胞自噬相关蛋白表达特点＊

邝宗和 陈进铭 叶小平 张海江 孙盛同

南方医科大学南方医院白云分院急诊科 (广东 广州 518120)

急性脑梗死(acute cerebral infarction，ACI)，又称缺血性脑卒中，是指由于动脉粥样硬化或血栓形成导致血管狭窄或闭塞从而引起的脑供血突然不足导致脑组织坏死的急性脑血管疾病[1]。急性脑梗死发病率高，是死亡率最高的疾病，并且常伴有难以治愈的并发症所以一直以来备受关注。为了更好地治疗急性脑梗死，人们一直致力于急性脑梗死发病机制的研究，目前认为缺血再灌注损伤，钙离子内流，神经细胞凋亡等与梗死部位脑组织不可逆损伤有关，在众多机制中神经细胞凋亡处于较为重要的地位[2]。自噬是细胞程序性死亡的一种方式，适当的自噬可以使真核生物内的物质循环利用，并降解自身代谢废物及异常的细胞器等，但是自噬的过度激活溶酶体会降解细胞的正常营养物质和损伤正常的细胞结构，反而会造成过量的能量消耗和自身损伤[3]。对于心肌细胞，神经细胞等不可再生细胞而言自噬在维持细胞的正常生理结构，生命活动发挥着重要的作用。国内外研究已经发现在心肌梗死患者的心肌中存在自噬现象，在大鼠等脑梗死动物模型种中也发现自噬现象的存在，但是在人类急性脑梗死种是否存在自噬现象尚未明确[4]。本研究探讨急性脑梗死时的单核细胞自噬蛋白表达的特点，以期为临床治疗做出参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象随机纳入我院2020年1月至2021年5月80例合急性脑梗死患者，患者年龄 49～72岁，平均 63.47±8.35岁，采用4种分组方法即：根据发病时间将急性脑梗死患者分为＜4.5h 组、4.5～6h 组和＞6h 3组；根据治疗情况分为溶栓治疗前、治疗后2组；根据NIHSS评分标准分成三组：轻度(NIHSS评分0～6分)、中度(NIHSS评分7～15分)、重度(NIHSS评分＞16分)；使用改良Rankin量表(mRS)评估预后，根据评分结果分成2组：预后不良组(mRS评分＞2分)，预后良好组(mRS评分≤2分)，纳入同期40例健康人作为对照组，患者年龄 51～70岁，平均60.52±7.83岁。

纳入标准：首次发病并且在72 小时内入院；症状，体征，影像学检查结果等满足急性缺血性脑卒中的诊断标准；NIHSS 评分为 4-20 分；患者及其家属签署知情同意书。排除标准：脑CT提示存在脑出血；既往有脑梗死病史且遗留神经功能缺损者；有严重心功能不全、慢性肝肾疾病者；1个月内存在怀孕、分娩、哺乳等情况者；血小板＜100×109/L 或血小板＞300×109/L和中度以上贫血者；24 小时内接受ACEI治疗；年龄＞85 周岁。同期选择健康对照组40例。对照组纳入标准：研究对象半年内未出现脑缺血性疾病，无冠心病、高血压等心血管疾病，无糖尿病、甲亢等内分泌性疾病。

1.2 实验方法

1.2.1外周血单核细胞的分离 入院的第1天、第14天抽取外周静脉血10mL，使用肝素抗凝，之后立即放置于4℃冰箱降温保存，从而抑制外周血中单核细胞的活性。冰箱中保存30min 后，取5mL血液用3 000r/min的速度进行离心10min，血清标本置与-80℃的冰箱中冷存；密度梯度离心剩余的5mL静脉血，按照单核细胞的贴壁特性，分离出单核细胞。

1.2.2 Western blot 检测单核细胞中的MAP1-LC3、Beclin-1 及Atg5-Atg12含量 将单核细胞使用 RIPA 裂解液裂解，提取总蛋白，在每个泳道中加入总蛋白40μg。用BCA 法测各组蛋白浓度。使用15% SDS-PAGE进行90V/120V 恒压电泳，湿转(200mA，50min) 到 PVDF 膜上，5%脱脂牛奶室温封存2h，并且加入MAP1-LC3 兔抗人多克隆抗体、Beclin-1 兔抗人多克隆抗体、Atg5 兔抗人多克隆抗体(1∶1000 稀释) 和β-actin 鼠抗人单克隆抗体(1∶1000 稀释) ，加入之后4℃孵育，TBST洗涤，β-actin 加入辣根过氧化酶标记山羊抗鼠IgG(1∶5000 稀释)，MAP1-LC3 加入辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG(1∶5 000 稀释)，两者均于室温孵育 90min，TBST 洗涤后，ECL 化学发光试剂显影。

1.2.3 线粒体偶联因子6(CF6)入院时及第14天空腹抽取肘静脉血10mL，置于含促凝剂的采血管中，将采血管在2800转/分钟，4℃环境下，离心30分钟并获取上层血清，-2℃保存备用。CF6的浓度使用ELISA方法检测。

1.3 观察指标外周血单核细胞中的 MAP1-LC3、Beclin-1 及Atg5-Atg12 含量，CF6浓度，并将各组患者的自噬相关蛋白含量与各种临床参数进行相关分析，将自噬相关蛋白含量与CF6浓度之间进行Logistac分析，分析其相关性。

1.4 统计学方法选择SPSS 17.0 统计软件分析数据。正态分布的计量资料以(±s)表示，比较选择t检验；偏态分布的计量资料以四分位数间距M(QR)表示，比较选择Mann-Whitney U 检验；计数资料以率(%)表示，比较运用χ2检验。相关分析采用spearman相关分析。使用受试者工作特征(ROC)曲线评估急性脑梗死患者外周血单核细胞自噬水平对脑梗死患者预后的预测能力。以双侧P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同时间MAP1-LC3、Beclin-1及 Atg5-Atg12的含量＜4.5h组、4.5～6h 组和＞6h组均较健康对照组的MAP1-LC3、Beclin-1 及 Atg5-Atg12的含量高，且＞6h组高于4.5～6h 组高于＜4.5h组，差异有统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 不同时间各组MAP1-LC3、Beclin-1 及 Atg5-Atg12的相对丰度值

2.2 不同NHISS评分组MAP1-LC3、Beclin-1及 Atg5-Atg12的含量 轻度，中度，重度三组均较健康对照组的MAP1-LC3、Beclin-1 及 Atg5-Atg12的含量高，且重度组高于中度组高于轻度组，差异具有统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 不同NHISS评分各组MAP1-LC3、Beclin-1 及 Atg5-Atg12的相对丰度值

2.3 治疗前后MAP1-LC3、Beclin-1及 Atg5-Atg12的含量 治疗前，治疗后2组均较健康对照组的MAP1-LC3、Beclin-1 及Atg5-Atg12的含量高，治疗后组低于治疗前，差异具有统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表3 治疗前后各组MAP1-LC3、Beclin-1 及 Atg5-Atg12的相对丰度值

2.4 不同预后组MAP1-LC3、Beclin-1及 Atg5-Atg12的含量 预后不良组，预后良好2组均较健康对照组的MAP1-LC3、Beclin-1 及 Atg5-Atg12的含量高，预后良好组低于预后不良组，差异具有统计学意义(P＞0.05)，见表4。

表4 不同预后各组MAP1-LC3、Beclin-1 及 Atg5-Atg12的相对丰度值

2.5 MAP1-LC3、Beclin-1及 Atg5-Atg12的变化与线粒体偶联因子6(CF6)变化的相关性 根据Logistac分析各个患者的MAP1-LC3、Beclin-及 Atg5-Atg12的含量变化与线粒体偶联因子6(CF6)变化具有相关性。

3 讨 论

除细胞凋亡之外人们还发现了第二种细胞程序性死亡方式—自噬，是细胞通过溶酶体的作用降解各种细胞内异常的细胞器，以及各种代谢废物的过程。已有大量研究表明自噬过程与心肌梗死过程存在密切联系，自噬在脑梗死动物模型种的作用也有一定的研究[5-6]。在脑梗死时由于血液供应不足造成大量细胞因缺血缺氧而出现结构和功能异常，此时自噬过程就有可能会启动吞噬各种代谢废物及功能异常的细胞器帮助细胞维持正常功能起到保护作用[7]，但是在缺血再灌注期又有可能因自噬的过度激活造成细胞自噬正常的细胞结构而造成细胞损伤[8]。自噬是把双刃剑，自噬在急性脑梗死种到底起着怎样的作用，在急性脑梗死的治疗种应该怎样处理自噬，自噬的过度激活的机制，适当的处理自噬在脑梗死的临床治疗中的意义等等都是目前亟待解决的问题[9]。急性脑梗死目前虽然已经有明确的治疗指南，但是治疗效果以及治疗后后遗症的处理任然需要进步，自噬或许可以成为一把治疗的钥匙，可以辅助超早期溶栓治疗提高疗效，减少许多不可逆损伤[10-12]。

本研究的目的是探讨不同时间，不同预后，不同严重程度的急性脑梗死中外周血单核细胞中自噬相关蛋白的表达的变化情况，及其与线粒体功能改变的相关性，从而了解在急性脑梗死中是否存在自噬过程，自噬的作用如何，自噬作用发生的机制如何是否与线粒体功能有关。研究结果表明急性脑梗死的自噬相关蛋白表达水平高于健康对照组，且随着患病时间的延长自噬相关蛋白表达逐渐升高，随着严重程度的增加即NHISS评分的升高自噬相关蛋白表达逐渐升高，治疗后自噬相关蛋白含量明显低于治疗前，并且预后不良的患者的自噬相关蛋白含量明显高于预后良好的患者，并且自噬相关蛋白表达的变化与线粒体功能变化指标CF6的改变具有良好的相关性。

综上所述，急性脑梗死过程中确实存在着自噬过程，并且自噬过程的强弱与急性脑梗死的时间和严重程度相关，自噬过程与急性脑梗死的不良预后有相关性，自噬过程在急性脑梗死的治疗即疗效评估中具有一定的临床意义，并且自噬过程的过度激活可能与线粒体的损伤有关。