结核病相关生物标志物IFN–γ检测技术研究进展

李继荣 王志坚

中国人民解放军南部战区海军第二医院感染科，海南三亚 572000

人类感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）已有数千年历史。结核病每年造成至少120 万人死亡。世界卫生组织提出到2030 年消除结核病大流行的目标。尽管付出巨大努力，结核病仍是世界范围内重大公共卫生问题。

长期以来，结核菌素皮肤试验在结核病辅助诊断中发挥着重要作用，其性价比高，操作简便，但其结果易受卡介苗接种和非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）感染的影响；GeneXpert MTB/RIF 可同时检测MTB 基因和利福平耐药，2h内完成检测，但价格昂贵，需专门检测平台。γ 干扰素（interferon–γ，IFN–γ）检测可提供活动性结核、潜伏性肺结核感染病理过程和宿主免疫反应的相关信息，是结核病诊断中常规使用的生物标志物之一，对早期诊断结核至关重要。

1 传统的IFN-γ 检测技术

γ 干扰素释放试验（interferon–γ release assay，IGRA）是通过检测单核细胞中MTB 特异性抗原（早期分泌抗原6 和培养滤液蛋白10）刺激下产生的IFN–γ 来判断被检测者是否存在MTB 感染。

目前有几种较常用的方法：①采用酶联免疫吸附测定（enzyme–linked immunosorbent assay，ELISA）检测全血中致敏T 细胞再次受到MTB 特异性抗原刺激后释放的IFN–γ 水平（QuantiFERON–TB Gold In Tube，QFT–GIT）。②QuantiFERON–TB Plus（QFT–Plus）是QFT–GIT 的升级版，与含有优化的CD4T 细胞刺激抗原的QFT–GIT 相比，QFT–Plus含有优化的CD4和CD8T 细胞刺激的新抗原。与QFT–GIT 相比，在成人结核潜伏感染患者中QFT–Plus 检测显示与MTB 暴露增加有更强的相关性，具有指示近期感染和疾病活动的潜力。③T–SPOT.TB是一种更简单的酶联免疫斑点试验方法，其检测灵敏度高，超过传统的ELISA，用于检测被结核特异抗原刺激活化的效应T 细胞。

IGRA 特异性更高，其阳性结果基本可排除卡介苗接种和NTM 感染，但IGRA 不能提供实时检测，只能在实验室进行，且操作专业要求高。因此，开发便携式、实时、高敏感度、成本低廉、便于操作的IFN–γ 检测技术至关重要。

2 传感器检测技术

由于传统的IFN–γ 检测技术对人员、仪器和实验平台要求高，因此，迫切需要设计一种高敏感度、快检快报提供实时分析的便携式系统。多年来，科学家们在生物传感器领域取得了巨大的进步，并将其广泛应用到疾病诊断相关领域。生物传感器由生物受体和传感器组成。生物受体是一种生物化合物（如抗体、酶、细胞、核酸等），附着于特定的分析物上。换能器是一种将生物反应转换为可测量信号的组件。与传统的检测技术相比，生物传感器具有高灵敏度和高特异性，能检测各种复杂样品，且操作简便，方便携带，可提供实时检测，是极富潜力的诊断方法。

2.1 荧光适配体传感器

荧光适配体传感器是荧光标记和适配体传感器的巧妙结合。以适配体作为生物识别元件的生物传感器称为适配体传感器。适配体是人工合成的单链DNA 或RNA 分子，当与目标结合时改变其构象。近年来，由于其具有较高的化学稳定性和热稳定性，易于修饰，对目标具有较高的特异性和亲和性，重复性好，它们已成为抗体的替代品。在荧光传感器中，对生物识别元件或目标分子进行荧光标记，荧光强度即代表目标分子与生物识别分子之间的相互作用强度。Zhang等开发了一种具有高灵敏度和高特异性的孔雀石绿–四重适配体荧光生物传感器用于检测IFN–γ。在实际样品中，其检出限为7.65fmol/L，线性范围为0～20pmol/L，回收率为95.29%～118.08%。Wen等也开发了一种荧光传感器，IFN–γ 检出限为 0.175fmol/L，线性范围为0.01pmol/L～10nmol/L。

2.2 电化学适体传感器

电化学传感器的原理是将生物识别元件耦合到电极换能器，然后由换能器将生物识别事件转换成电信号。Xu等设计了一种以链霉素–无机杂化纳米花与石墨烯复合材料作为传感器的发夹式电化学适配体传感器，检测限为19fg/ml，线性范围为0.1pg/ml～500ng/ml。Abnous等开发了一种由三螺旋分子开关系统、适配体和亚甲基蓝氧化还原探针组成的电化学适体传感器，用于快速测定IFN–γ，检测限为3pg/ml，线性范围为10～1 500pg/ml，回收率为91.3%～102.8%。Li等开发了一种靶诱导外切酶抑制适体传感器，IFN–γ 检测限为0.7pmol/L，线性范围为1pmol/L～50nmol/L，回收率为91.83%～101.9%。该传感器成本低、敏感度高、选择性好、操作简单、重复性好。Ding等制作了一种三面单层电化学适体传感器，IFN–γ 检出限为11.56pmol/L，线性范围为22.22pmol/L～0.11nmol/L。Jin等制作了一种无标记电化学适配传感器，以亚甲基蓝作为氧化还原探针，其信号随着IFN–γ 的增加而稳定提升。IFN–γ 检出限为2fg/ml，线性范围0.01～1000pg/ml，回收率为95.2%～105%。Cao等开发了一种可重复使用的氧化石墨烯适体传感器装置，IFN–γ 检出限为1.3pg/ml，线性范围为1.3～210pg/ml。

2.3 电化学免疫传感器

当生物传感器中的生物识别元件是抗体时，它被称为免疫传感器。免疫传感器利用抗体与抗原的高度亲和力，使用恰当的信号传感器来确定特定的分析物。Sánchez–Tirado等设计了一种电化学免疫传感器，用于检测唾液中的IFN–γ。该生物传感器的核心是三明治结构，通过重氮盐和对氨基苯甲酸将IFN–γ 抗体固定在电极表面。检测抗体以生物素标记，并与链霉素–辣根过氧化物酶耦联。检出限为1.6pg/ml，线性范围为2.5～2000pg/ml。Ruecha等制作了一种无标记纸基阻抗免疫传感器，用聚苯胺–石墨烯修饰纸基电极，并将人IFN–γ 抗体固定其上。该方法特异性、敏感度高，操作简便，成本低。检出限为3.4pg/ml，线性范围为5～1000pg/ml，回收率为101%～104%。Zhang等也开发了一种由聚二烯丙基二甲基氯化铵和金纳米颗粒复合材料组成的三明治式电化学免疫传感器，检测限为0.048pg/ml，线性范围为0.1～104pg/ml。Parate等设计了一种可以测定细胞因子、IFN–γ 和白细胞介素–10 的免疫传感器。该装置检测IFN–γ 的线性范围为0.1～5ng/ml，检出限为25pg/ml。

3 微流体检测技术

近年来，在资源贫乏的国家，微流体装置已成为一种可能的诊断工具。微流体设备是基于芯片的传感技术，小样本量即可提供实时的传染病诊断。应用微流体技术可分析大量的临床样本，如尿液、血液或唾液。具有成本低、体积小、可批量生产的优势。Yang等制作了一种高敏感度的微芯片电泳化学发光检测平台。以辣根过氧化物酶标记DNA为化学发光检测信号探针，结合核酸外切酶信号扩增策略，实现对人血浆中IFN–γ 的快速检测。检测限为1.6fmol/L，线性范围为8×10～1×10mol/L。Liu等制作了一种微流体装置，可连续检测血清和细胞培养中的IFN–γ。该装置采用聚二甲基硅氧烷制作而成，利用磁场将磁性纳米颗粒附着于微处理器芯片上，构建传感检测平台。检出限为6pg/ml，线性范围为10～500pg/ml，回收率为98%～102%。Evans等设计了一个电路板传感器检测平台，其检出限为40pg/ml，线性范围为15～2000pg/ml，回收率为93%～97%，该系统整个诊断分析过程仅需8min。

4 展望

近几十年来，由于贫困、合并感染后的免疫抑制、抗生素滥用及结核菌耐药等原因，结核病大有“死灰复燃”趋势。为阻止结核病的进一步蔓延，及早发现和诊断结核成为重中之重。多年来，已有多种方法用于检测结核病，如古老的结核菌素皮肤试验和近些年开展起来的GeneXpert 技术，这些检测方法都有着各自的局限性。IFN–γ 作为当前结核病早期诊断的主要生物标志物已得到广泛应用，不仅可用于潜伏期结核感染的筛查，也可与其他方法联合应用于活动性结核病的临床诊治。

对于IFN–γ 检测技术的研究也一直在不断创新和改进中。传统的IGRA 虽然可排除卡介苗接种和NTM 干扰，特异性也较高，但费时费力，不能区分潜伏肺结核和活动性肺结核，敏感度不高（尤其在免疫功能低下群体）。随着生物传感检测平台的引进，IFN–γ 检测的敏感度、特异性和便携度均得到明显提升。与传统技术相比，生物传感检测平台在检测精度、成本和时限方面都具有显著优势。尽管生物传感器有很多优点，但要将其广泛应用于临床实践还有很长的路要走。在传感系统中引入微流体技术及芯片阵列，最大限度地降低了对大型实验设备的使用需求。然而，目前微流体技术在商业市场的应用才刚刚起步，实际应用存在诸多挑战，如大样本原始数据分析和大规模生产微流体装置的成本等，都需要进一步的研究来评估其可行性。相信随着人们对IFN–γ 检测技术研究的不断深入，更敏感、更高效、更便携、更高性价比的高科技装置会不断涌现在人类结核病的诊疗实践中。