不同采收期对野菊花质量的影响

程龙，任永申，李艳秋，焦马静，汪迎洲，梅之南

（中南民族大学 药学院，武汉 430074）

野菊花（Chrysanthemi Indici Flos）为菊科植物野菊Chrysanthemum indicumL.的干燥头状花序，味苦、辛，微寒，归肝、心经，具有清热解毒，泻火平肝的功效［1］.野菊花含有黄酮类、萜类、挥发油类、苯丙素类、酚酸类、多糖类等多种化学成分［2-8］.现代药理学研究表明，野菊花具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、调节免疫、抑制炎症、保护心肌血管、保肝、保护神经等作用［9-13］；临床常用于流行性感冒、感冒、高血压、肝炎、疮痈肿毒等疾病的治疗，是复方感冒颗粒等中成药品种的主要原料药.

野菊花目前已建立了GAP种植基地.野菊花开放时间正常为25 d左右，可分为花蕾期、初花期、盛花期、终花期.本项目采集了四个时期的野菊花样品，测定了生物量、建立了化学指纹图谱并考察了其抑菌作用，以期为合理确定野菊花采摘期提供科学依据.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

野菊花采自湖北省阳新县白沙镇野菊花种植基地，经中南民族大学梅之南教授鉴定为野菊（Chrysanthemum indicumL.）的干燥头状花序.样品采于2020年9月中旬至10月中旬，根据采收时间，将样品分为花蕾期（HL）、初花期（CH）、盛花期（SH）、终花期（ZH）；另外采集了盛花时期的茎叶（JY）（图1）.对照品绿原酸、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素购于上海源叶生物（批号：Y20A11K111541、Y13J10H93050、Y14010H98541、Y27F11Y17056，HPLC归一化法检测，其纯度均大于98%）.大肠杆菌 标 准 菌 株Escherichia coli（E.coli）（CCTCC AB 93154）、金黄色葡萄球菌标准菌株Staphylococcus aureus（S.aureus）（CCTCC AB 91093）由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供.

图1 不同采收时期野菊花样品（含茎叶样品）Fig.1 Chrysanthemum indicum samples from different collected periods（including samples with stems and leaves）

1.1.2 仪器与软件

C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国赛默飞）；高效液相色谱仪（戴安UltiMate3000，美国赛默飞）；中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版（国家药典委员会）；DPS数据处理系统软件（浙江大学）；分析天平（CP214，奥豪斯仪器，）；手提式高压灭菌锅（DSX-30L，上海申安）；摇床培养箱（THZ-92C，上海博讯），隔水式恒温培养箱（GRP-9050，上海森信）.

1.1.3 试剂

无水乙醇（国药集团）；甲醇、乙腈（美国TEDIA公司）；硫酸庆大霉素注射液（华中药业，批号：20180608）；营养肉汤培养基、营养琼脂培养基（北京索莱宝）.

1.2 野菊花样品生物量测定

随机选择各时期野菊花干燥花朵50粒，分析天平精准称量并记录，各样品均测定3批.

1.3 野菊花样品HPLC指纹图谱测定

1.3.1 供试品溶液制备

将各样品粉碎后过60目筛，分别称取约25 g.加入10倍量纯化水，回流提取2次，每次1 h，抽滤，合并两次提取液，减压浓缩至浓度约为1.5 g/mL（以生药量计），取浓缩液1 mL，加入甲醇至5 mL，超声处理30 min，用0.45 μm微孔滤膜过滤，收集续滤液备用.

1.3.2 对照品溶液制备

绿原酸、蒙花苷、木犀草苷、木犀草分别用甲醇溶解，超声处理0.5 h，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液1 mL定容至25 mL，得到浓度分别为：0.86 mg/mL、0.40 mg/mL、0.56 mg/mL、0.78 mg/mL的混合对照品溶液，备用.

1.3.3 色谱条件

采用高效液相法采集各样品化学指纹图谱，按表1条件进行梯度洗脱，柱温30℃，检测波长334 nm，进样量20 μL，流速1.0 mL/min［14］.

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedure

1.4 野菊花样品抑菌活性测定

1.4.1 菌株的活化

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌于营养肉汤培养基中，放入37℃的摇床培养箱中活化18 h后，接种传代后取生长旺盛期菌液置于4℃冰箱中保存备用.

1.4.2 菌悬液的配制

取保存的细菌母液按梯度进行稀释，制备为菌液浓度为1×105～1×106cfu/mL菌悬液，备用.

1.4.3 抑菌实验

取各样品水提物浓缩液，于121oC灭菌30 min，作为供试品溶液；以庆大霉素（浓度为25 μg/mL）为阳性对照药.采用牛津杯法，取100 μL菌悬液至营养琼脂培养基中，在每个培养皿中均匀放入3个牛津杯，每个牛津杯中加入200 μL药物，最后在37℃培养箱培养24 h.每个实验做三次平行实验.

1.5 灰色关联分析

在野菊花样品化学指纹谱中确定主要色谱峰，以蒙花苷（P12）为参照峰，计算各个色谱峰的相对峰面积；按照灰色关联分析法［15］，利用DPS数据处理系统软件，以抑菌圈综合评分为母序列，以各色谱峰相对峰面积为子序列，计算各峰与抑菌作用的关联度.

2 结果

2.1 生物量

野菊花花朵生物量测定结果表明，从花蕾期到盛花期生物量不断增加，在盛花期时达到最大值（P＜0.01）；而从盛花期到终花期，植物生长由盛转衰，物质消耗大于积累、加之花瓣败落等原因，导致生物量逐渐降低；同朵数生物量顺序为SH＞CH＞ZH＞HL（表2）.

表2 各样品生物量测定结果Tab.2 Results of biomass determination of YJH samples

2.2 野菊花样品HPLC图谱分析

取1.3.1供试品和1.3.2对照品溶液，采用高效液相色谱法，按1.3.3色谱条件，采集对照品图谱和野菊花及茎叶水提物HPLC化学图谱（图2、图3）.采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对5个样品的药材化学图谱进行比较分析，共确认14个主要色谱峰（图4），相似度计算结果见表3.

表3 相似度分析表Tab.3 Similarity analysis of YJH samples HPLC fingerprint

图2 混合对照品HPLC图谱Fig.2 HPLC profile of mixed reference substance

图3 野菊花及茎叶样品水提物HPLC谱图Fig.3 HPLC spectrum of water extract of YJH samples

图4 野菊花样品共有峰Fig.4 HPLC fingerprint common peak of YJH samples

以盛花期样品图谱为参照，花蕾期的野菊花样品与其他样品差异较大，其次为茎叶样品和终花期样品，表明野菊花生长各阶段化学成分差异明显；从HPLC图谱看，野菊花茎叶和盛花期样品图谱也有一定相似性，提示其可能有一定的开发利用价值.

从化学成分上看，蒙花苷的峰面积最大且最稳定，故以蒙花苷（P12）为内标峰，各共有峰的相对保留时间见表4；以蒙花苷的峰面积为参照，计算各共有峰相对峰面积见表5，其中P3（绿原酸）、P7、P8、P9、P11、P12（蒙花苷）峰面积较大.各样品相比，花蕾期蒙花苷相对峰面积较高；初花期、盛花期、终花期所含化学成分种类较为相似，并以盛花期样品最为全面且总量最高；茎叶样品与花相比绿原酸等苯丙素类成分相对峰面积较大.

表4 共有峰相对保留时间Tab.4 Relative retention time of common peaks

表5 共有峰相对峰面积Tab.5 Relative peak area of common peak

2.3 抑菌效果比较

从表6可知，与盛花期样品（SH）相比，花蕾期样品（HL）对E.coli抑菌作用较强，可能与其含有较多的蒙花苷抑菌活性成分有关；终花期样品抑菌作用较弱，表明随着终花期样品的衰败，其生物量降低、活性成分含量降低，其抑菌作用也降低（P＜0.01）.

表6 野菊花提取物抑菌圈直径Tab.6 Diameter of inhibition zone of YJH sample water extract

对S.aureus的抑菌作用显示，与SH样品比较，HL样品抑菌作用较强（P＜0.01），而CH样品抑菌作用较弱（P＜0.05），其他样品作用略优于SH.以SH为参照，各样品对E.coli、S.aureus的抑菌作用的加权评分（设定权重均为50%）结果表明，抑菌作用顺序为HL＞SH＞CH＞JY＞ZH.花蕾期样品抑菌作用最强，盛花期次之，而终花期最弱，甚至弱于盛花期茎叶样品，结果提示综合生物量指标，野菊花最佳采收期应为盛花期，且盛花期茎叶有较强抑菌作用，可以作为原料药加以研究利用，以实现资源综合利用.

DPS软件计算各共有峰峰面积与抑菌活性综合评分的关联序得出关联系数并按大小顺序排列见表7.据表可知P3（绿原酸）、P7、P9、P12（蒙花苷）、P8、P2的关联系数均在0.7以上，与抑菌效果关联性较强，可认定为野菊花抑菌作用的主要药效成分.

表7 关联系数表Tab.7 Correlation coefficient table

3 讨论

采收加工对中药质量具有显著影响［16］，合理确定采收期，对保证中药质量、提高产量、提升综合效益、降低劳动强度具有重要意义.野菊花是较常用中药品种，需要科学地确定其采收时期，以实现增产和高质量发展.

本研究结果表明，不同采收期的野菊花化学成分呈现规律性变化，从初花期到盛花期，野菊花花朵生物量增加，主要抑菌活性成分（灰色关联分析结果指认）种类逐渐丰富、总量增多，在盛花期达到顶峰，抑菌作用也随之较强；终花期样品化学成分、抑菌作用迅速下降，药用降低.上述结果提示，野菊花最适宜在盛花期采收，此时药材产量最大、药效较好、质量较优，能够实现药效价值与经济效益的最优化.研究同时表明，盛花期野菊花茎叶也具有丰富的化学成分、较好的抑菌作用，具有潜在的开发利用价值.