Piezo1离子通道介导的流体剪切应力抑制MLO-Y4骨细胞凋亡

刘众成，何良志，移穷，刘雪宁，张坤，王力夫，耿彬，夏亚一，姜金

兰州大学第二医院骨科/甘肃省骨与关节疾病重点实验室，甘肃兰州 730000

前言

我国罹患骨质疏松人口数量居于世界首位［1］。骨质疏松作为一种好发于中老年人群的慢性、退行性疾病，具有全身骨量减少、女性多于男性、易发生脆性骨折等特点，该疾病是引起50 岁以上人群脆性骨折的主要危险因素［2］。世界范围内50 岁以上女性中有1/3、男性中有1/5 以上会出现骨质疏松相关骨折［3］。预估我国将在2050年时每年会出现600 万例因骨质疏松而产生的脆性骨折并造成250 亿美元以上的经济负担，这也比我国2010年同期数据增长了2.7 倍［4］。这提示了尽管随着我国经济迅猛发展，人口老龄化导致罹患骨质疏松的人口基数正在不断增长。因此，探究骨质疏松的病因、发病机制，延缓骨质疏松进程便成为了亟待解决的医疗问题。

生理状态下骨量的维持由骨形成、骨重塑与骨吸收建立动态平衡而实现［5］。作为哺乳动物体内骨骼中含量最丰富的细胞—骨细胞在骨形成、骨重塑以及骨量维持发挥着重要作用［6］。骨细胞是骨组织中最主要的机械感受细胞，其通过感受机械刺激发挥内分泌功能［7］。同时，小鼠MLO-Y4细胞系是作为体外实验研究骨细胞应用最广的细胞系［6］。自1892年提出Wolff定律以来，机械应力对骨组织的影响逐渐被研究者所重视［8］。Wolff定律提示：骨骼可以接受机械应力的信号并受其影响，机械载荷可以刺激骨形成。目前认为适量力学刺激有利于维持骨量与骨组织的生理功能。Piezo1/2通道（或称：Fm38A/B）由Coste及其同事在2010年发现［9］。Piezo通道蛋白在骨骼疾病中的研究于2017年开始，Sugimoto等［10］发现Piezo1在静水压下通过调节骨形态生发蛋白2表达决定间充质干细胞的命运。然而，机械应力刺激下Piezo1是否对骨细胞表型具有影响目前尚缺乏相关研究。

凋亡又称细胞生理性、程序性死亡［11］。凋亡是细胞内稳态的关键自发性过程，对细胞的健康状态起着重要作用［12］。Tan 等［13］认为凋亡的Ocy 吸引微环境中的Oc，进而对骨重建产生影响，并发现机械应力抑制肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）诱导的Ocy 凋亡。Yan 等［14］通过流式细胞凋亡检测发现机械应力可以有效抑制MLO-Y4 细胞凋亡。因此，机械应力对预防或减缓骨细胞凋亡甚至是骨质疏松具有重要作用。然而，具体哪些分子以及调控机制参与其中仍存在一定的不确定性。流体剪切应力（Fluid Shear Stress,FSS）作为体外模拟生物体内应用的最佳机械应力，被广泛应用于体外细胞实验。因此，本研究将对Piezo1机械敏感性钙离子通道介导的FSS抑制MLO-Y4骨细胞凋亡进行研究。

1 方法

1.1 实验试剂

MLO-Y4 骨细胞购于上海富衡生物科技有限公司。试剂：α-MEM 培养基（Hyclone,美国），胎牛血清（Gibco,美国），胰蛋白酶（Gibco,美国），青霉素-链霉素溶液100X、磷酸盐缓冲液（PBS）、4%多聚甲醛、Triton-X100（Beyotime,中国），DAPI 染色液（Biosharp,中国），Piezo1 一抗、Bcl-2 一抗、Bax 一抗、β-actin一抗、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗、山羊抗兔荧光二抗-488（Proteintech,中国），Hoechst-33258 即用型染色液（Solarbio,中国），Annexin V-PI 凋亡检测试剂盒（Yeasen,中国）。

1.2 细胞培养

将青霉素-链霉素溶液100X抽取1 mL加入至9：1比例的完全培养基（α-MEM：胎牛血清）中，细胞培养瓶中加入4 mL 完全培养基，将细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱内，每日观察1 次，细胞增长至90%密度进行1：2 传代。传代前使用PBS 轻柔清洗残余培养基两遍，加入500 μL胰蛋白酶悬浮细胞后加入3.5 mL完全培养基重新置入培养箱。

1.3 细胞干预

按课题组既往操作将细胞置于课题组自行研发的FSS 加载装置中，调整加载参数，待加载完成后取出玻片进行下一步操作［15］。该FSS 加载装置由6 通道平行小室构成，通过计算机监控实时加载的FSS大小，由计算机监控系统、储液系统、加载系统以及脉管系统构成［16-17］。Piezo1激动剂Yoda1溶解于DMSO并配置成100 μmol/L浓度，将其加入需要进行干预的细胞培养瓶并使最终浓度为10 μmol/L，作用2 h。Piezo1阻滞剂GsMTx4溶解于PBS并配置成10 μmol/L浓度，将其加入需要进行干预的细胞培养瓶并使最终浓度为4 μmol/L，作用0.5 h。

1.4 免疫荧光

首先使用4%多聚甲醛进行固定30 min（室温），PBS 清洗3 遍，接下来将细胞置于1%Triton-X100 中通透30 min（室温），PBS 清洗3 遍，然后将细胞置于10%山羊封闭血清封闭30 min（37 ℃），PBS 清洗3遍，将细胞置于Piezo1 一抗（1：300）中过夜（4 ℃），PBS 清洗5 遍，然后将细胞置于荧光二抗（-488）中染色1 h（37 ℃），PBS 清洗5 遍，最后将细胞置于DAPI染色液中15 min（37 ℃）并在荧光显微镜下观察细胞。

1.5 Hoechst-33258染色

封闭及之前步骤同免疫荧光，PBS清洗完成后将细胞置于Hoechst-33258 即用型染色液中染色20 min（37 ℃）并在荧光显微镜下观察细胞。

1.6 Western Blot检测

使用RIPA 细胞裂解液与PMSF 以100：1 比例配置裂解液，向干预完成的细胞中加入1.0 mL 裂解液冰上裂解30 min，12 000 rpm 离心20 min 后弃去沉淀。向剩余裂解液中加入1/3 的4x 蛋白质上样缓冲液。蛋白在10%SDS-PAGE 胶中120 V 电泳，待电泳完成后350 mA恒流转印30 min，封闭1 h后将转印膜置于相应一抗中4 ℃过夜，接下来取出转印膜并置于相应二抗中作用1 h。拭干转印膜后滴加ECL 发光液并曝光。

1.7 流式细胞检测凋亡

使用不含EDTA 的胰蛋白酶悬浮细胞后将其加入流式管中，依照AnnexinV-PI 凋亡检测试剂盒说明书依次配置试剂，将流式管插入流式细胞仪定量计算细胞凋亡率。

1.8 统计学方法

所有需要进行定量分析的实验均至少进行3 次独立实验。首先使用K-S 检验（Stata 15.0 软件）计算所得数据是否满足正态分布。所有满足正态分布的数据用均数±标准差表示，使用双尾t-检验或单因素方差分析（Graphpad 8.0 软件）计算是否具有统计学意义并绘制统计图。Image-J（1.52 版本,美国）用于计算免疫荧光强度及Western blot 条带灰度值。Adobe Illustrator（2019 版本,美国）进行图像组装及成图。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FSS激活并上调Piezo1表达

对FSS调控Piezo1通道蛋白的表达进行探究，分别探究不同FSS力梯度（0、3、6、9、12、15、18 dyne/cm2）以及不同时间梯度（0、15、30、45、60、90、120 min）对MLO-Y4 细胞Piezo1 通道蛋白的调控作用。如图1所示，在MLO-Y4细胞中使用免疫荧光染色对Piezo1通道蛋白进行染色，当加载条件为FSS 力梯度时，9、12 dyne/cm2与空白组Piezo1 免疫荧光强度具有较明显差异（图1a）；当加载条件为FSS时间梯度时，30、45 min 与空白组Piezo1 免疫荧光强度具有较明显差异（图1b）。

2.2 激活Piezo1通道蛋白抑制MLO-Y4细胞凋亡

按前文条件对Piezo1 进行激活使用的Yoda1 为干预条件（10 μmol/L,2 h）；使用的GsMTx4为干预条件（4 μmol/L,0.5 h），分别与空白组进行比较，观察Cleaved Caspase-3、Bcl-2 以及Bax 分子的相对表 达量。如图2所示，使用Yoda1 对MLO-Y4 细胞进行干预时，Cleaved Caspase-3 以及Bax 的蛋白表达量相较于空白组显著下调（P＜0.000 1,P=0.014 8），Bcl-2的蛋白表达量相较于空白组显著上调（P=0.046 1）；相对应地，当使用GsMTx4 进行干预时，Cleaved Caspase-3、Bax的蛋白表达量相较于空白组显著上调（P=0.006 5,0.014 7），Bcl-2 的蛋白表达量相较于空白组显著下调（P=0.035 6）（图2a～图2d）。Hoechst-33258 染色显示空白组凋亡率为9.35%±1.07%，Yoda1 组凋亡率（6.19%±1.03%）显著下调（P=0.007 3），而GsMTx4组凋亡率（26.02%±2.58%）显著上调（P=0.042 0）（图2e～图2f）。

2.3 Piezo1介导的FSS抑制MLO-Y4细胞凋亡

按前文条件探究Piezo1介导的FSS对MLO-Y4细胞凋亡的影响，设立4个组：空白组、FSS组、GsMTx4组和FSS+GsMTx4 组，分别使用Western Blot、Hoechst-33258以及流式细胞凋亡检测技术对MLO-Y4的细胞凋亡进行探究。如图3所示，当加载FSS 对MLO-Y4细胞进行干预后，Cleaved Caspase-3 以及Bax的蛋白表达量相较于空白组显著下调（P=0.028 1,0.006 5），Bcl-2蛋白表达量相较于空白组显著上调（P=0.023 5）；当使用GsMTx4 对MLO-Y4 细胞进行干预后，Cleaved Caspase-3 以及Bax 的蛋白表达量相较于空白组显著上调（P=0.016 4,0.003 7），Bcl-2蛋白的表达量相较于空白组显著下调（P=0.034 2）；且FSS+GsMTx4组可以有效阻断GsMTx4对上述3种蛋白调控的影响（P=0.046 5,0.024 5,0.036 0）（图3a～图3c，图3f）。Hoechst-33258 染色显示空白组凋亡率为6.04%±0.34%，FSS 组凋亡率相较于空白组（2.25%±0.49%）显著下调（P=0.026 4），而GsMTx4 组凋亡率（11.12%±0.79%）相较于空白组显著上调（P=0.032 2），且FSS+GsMTx4 组（6.36%±0.40%）可以有效阻断GsMTx4对MLO-Y4细胞凋亡的调控作用（P=0.048 6）（图3d,图3g）。流式细胞凋亡检测显示空白组凋亡率为4.20%±0.10%，FSS 组凋亡率（3.21%±0.15%）相较于空白组显著下调（P=0.027 6），而GsMTx4组凋亡率（11.13%±1.00%）相较于空白组显著上调（P=0.030 6），且FSS+GsMTx4 组（6.69%±0.58%）可以有效阻断GsMTx4对MLO-Y4细胞凋亡的调控作用（P=0.012 3）（图3e,图3h）。

3 讨论

通过本实验发现FSS 上调MLO-Y4 细胞中Piezo1 通道的蛋白质表达，FSS 通过上调MLO-Y4 细胞中的Piezo1 通道蛋白进而调控MLO-Y4 细胞中的Cleaved Caspase-3、Bcl-2 以及Bax 蛋白质表达量，并最终抑制该细胞的凋亡。本研究为治疗骨量减少以及骨质疏松提供潜在的治疗靶点。

本实验首先探究FSS刺激下Piezo1离子通道的表达情况，并通过免疫荧光与Western Blot实验发现本课题组研发的FSS加载装置对MLO-Y4细胞的Piezo1表达呈现随加载时间以及力梯度增加的“先增后减”的单峰平滑曲线，以6～12 dyne/cm2加载15～45 min 条件下Piezo1呈现表达增高，其中以9 dyne/cm2加载30 min为上调MLO-Y4细胞中Piezo1通道蛋白的条件为最佳。Williams等［18］发现FSS加载范围在6～60 dyne/cm2时，新生大鼠颅骨细胞的钙应答会随着剪切应力的增加而增加。Kapur等［19］发现当FSS加载20 dyne/cm2持续1 h后，人成骨细胞的增殖显著增加。而Bin等［20］发现当加载条件为12 dyne/cm2持续1 h后，鼠源MC3T3-E1系成骨细胞通过细胞外信号调节激酶5信号通路显著抑制其凋亡。通过分析上述结果，发现用于模拟体内骨骼微环境的FSS强度对于不同分子的最佳刺激条件不尽相同，普遍的FSS加载条件为6～20 dyne/cm2。

其次，本实验通过探究骨细胞（MLO-Y4细胞系）中对Piezo1 进行FSS 后上调、激活剂Yoda1 以及阻滞剂GsMTx4 等干预后发现Piezo1 上调表达量或阻滞其表达会影响MLO-Y4 细胞凋亡表型。Piezo1 离子通道自2010年被发现以来，已探明其与体内多种周围微环境存在FSS的细胞相关疾病有关，例如在血管内皮细胞膜富集的Piezo1 参与调控生物体血压［21］、在红细胞细胞膜富集的Piezo1 突变导致溶血性贫血［22］以及在成骨细胞中Piezo1 缺乏可以进一步引起骨丢失［23］等。Sun 等［24］发现敲除成骨细胞Piezo1 基因破坏了成骨细胞的成骨过程并严重损坏了骨的结构和强度。Li 等［25］首次报道了FSS 决定骨细胞中Piezo1 的基因表达变化，且成骨细胞和骨细胞中Piezo1缺失导致小鼠骨量显著下降。

本研究通过Western Blot实验、Hoechst-33258 以及流式细胞检测细胞凋亡等多方面验证了Piezo1 介导的FSS可以改善MLO-Y4细胞状态并抑制其凋亡，并同时发现Piezo1 的特异性阻滞剂GsMTx4 有促进其凋亡的作用，揭示了Piezo1在对抗骨细胞凋亡中的作用。Tan 等［13］认为凋亡的骨细胞吸引微环境中的破骨细胞，进而对骨重建产生影响，并发现FSS 抑制TNF-α 诱导的骨细胞凋亡。Yan 等［14］通过流式细胞凋亡检测发现FSS可以有效抑制MLO-Y4细胞凋亡。本研究通过对MLO-Y4 细胞加载FSS 对Piezo1 离子通道的最佳上调条件（9 dyne/cm2持续30 min）后发现Piezo1 介导的FSS 抑制MLO-Y4 细胞凋亡，首次揭示了Piezo1为FSS抑制骨细胞凋亡的重要调控分子。

4 结论

Piezo1 机械敏感性离子通道介导的FSS 在9 dyne/cm2条件下抑制MLO-Y4 骨细胞凋亡，且FSS在该条件下可以有效逆转Piezo1 阻滞剂GsMTx4 在4 μmol/L作用0.5 h下促进MLO-Y4细胞凋亡作用。