牦牛肉中莱克多巴胺和阿维菌素残留物的快速检测方法

杨文蕾，牛贵姗

1.青海省动植物检疫站，青海西宁 810000；2.青海省药品审评核查中心，青海西宁 810000

1 前言

青海省现代畜牧业发展过程中，畜产品的生产、加工和消费过程始终伴随着畜产品质量安全问题，主要表现为畜禽产品加工技术标准体系相对落后、监测预警能力薄弱、畜产品质量安全保障体系不够完善，致使畜产品中危害食品安全的问题依然突出，畜产品的质量指标与国际标准不对接、溯源体系不完备、畜产品质量检测机构发展不平衡、政府监管部门的风险预警能力薄弱、企业的自查能力较弱等，缺乏对畜产品质量安全的预判性，对问题产品的溯源性能力较弱[1]。

通过牦牛肉中莱克多巴胺和阿维菌素的快速检测方法的研究，可有效推动我省牦牛肉食品安全监控工作的开展。

2 研究方法

2.1 确定抗原

本研究所用的莱克多巴胺、阿维菌素抗原免疫原浓度分别为2、 4.7 µg/kg,包被原浓度分别为4.4、5.26 µg/kg。

2.2 确定单克隆抗体

单克隆抗体制备所用的免疫动物为6～8周龄的健康雌性Balb/c小鼠8只，共免疫6次，每次免疫间隔时间均为2周，选取血清效价高、IC50低的小鼠用于细胞融合，采用有限稀释法进行细胞克隆，克隆完成后采用小鼠体内诱生腹水法制备单克隆抗体[2]。免疫方案详见表1。

表 1 小鼠免疫程序

选取效价高、抑制水平高的Balb/c小鼠用于细胞融合，采用有限稀释法进行细胞克隆，克隆完成后采用小鼠体内诱生腹水法制备单克隆抗体，采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水中的单克隆抗体。

采用ELISA和间接竞争ELISA方法测定抗体效价和IC50值，评价其灵敏度。单克隆抗体IC50结果分为别RAC 0.228 µg/kg和AV 0.751 µg/kg。

选取目标物的结构类似物作为抑制剂，采用间接竞争ELISA测定各抑制物的IC50，计算其交叉反应率，交叉反应率（%）=IC50（目标物）/IC50（结构类似物）×100%。结果显示莱克多巴胺、阿维菌素抗体与其他类似物标准品交叉反应性好[2,3]。

2.3 确定抗体探针

采用200 nm荧光微球作2种抗体的标记物，莱克多巴胺、阿维菌素抗体的用量（抗体浓度约2.0 mg/mL）分别为：10、15 µL，荧光微球标记抗体复溶液配方为0.1 M Tris-HCl（pH7.0），含0.5% Tween-20、0.5%BSA、2%海 藻 糖 和0.02% Procline-300，荧光微球的喷量为3 µL/cm[4,5]。

2.4 确定抗原包被

选择0.02 M PBS（pH7.4）做抗原包被液，分别将2种抗原稀释2、4、8和16倍，根据试纸条荧光强度和抑制情况可知，2种检测方法的最佳包被抗原稀释倍数分别为：RAC1:4、AV1:8。

2.5 确定样品垫

选用细玻纤（SB08）为样品垫，样品垫处理液配方为：0.02 M PB，含0.5% Tween-20，1%BSA，pH值7.5。

2.6 样本前处理方法

2.6.1 莱克多巴胺

称取2.00±0.05 g均质后的样品于50 mL离心管中；加入4 mL提取剂A，充分涡动3 min至完全分散，4 000 g以上离心5 min；取0.6 mL中间层清液于离心管中，加入33 µL提取剂B，充分混匀，待检。

2.6.2 阿维菌素

称取1.00±0.02 g匀质后的样品于10 mL离心管中，并加入2 mL样品提取液A，剧烈涡动1 min；加入4 mL提取液B，涡动3 min；4 000 g离心5 min，移取500 µL上层清液于5 mL离心管中，30 ℃氮气吹干；向吹干的离心管中加入400 µL复溶液，摇匀，待检[2,3]。

2.7 标准曲线方程

取牦牛肉样品各7份（每份不少于100 g），向其中添加莱克多巴胺标准溶液使其终浓度分别为：0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 µg/kg；添加阿维菌素标准溶液使其终浓度分别为：0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 µg/kg；充分混匀后，按照2.6进行样本提取。然后，按照EU-ICA方法进行检测。每个浓度重复检测5次，取平均值，以添加样本中靶标物的终浓度为X轴，检测线T荧光信号值与质控线C荧光信号值的比值（T/C）为Y轴，用origin8.0做非线性拟合分析，形成四参数拟合曲线：y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D，其中，y为测定信号T/C的比值；x为待测物浓度；A，B，C和D是标准曲线的四个参数，并以IC20～IC80为方法的线性检测范围，通过测试，标准曲线方程如下[4]。

莱克多巴胺的标准曲线方程为：Y=0.4015+(6.6439-0.4015)/[1+(x/0.9392)1.2497]，该 标 准曲线的线性区间（IC20～IC80）为0.483～4.347 µg/kg，线性相关性R2为0.9877。

阿维菌素的标准曲线方程为：y=0.507+(6.658-0.507)/[1+(x/1.859)1.364]，该标准曲线的线性区间（IC20～IC80）为0.965～8.685 µg/kg，线 性相关性R2为0.9887。

2.8 牦牛肉中莱克多巴胺的检测

2.8.1 定量限

分别测定使用EU-ICA免疫层析试纸测定仪器确证过的20个空白牦牛肉样本的平均值和相对标准偏差（SD），其平均值加上10倍标准差，即为定量限（LOQ）。经测定20个空白牦牛肉样本测定值分别为0.180、0.193、0.232、0.214、0.183、0.164、0.194、0.183、0.151、0.273、0.176、0.166、0.244、0.183、0.202、0.175、0.169、0.178、0.179、0.175 µg/kg,计算平均值为0.191 µg/kg,标准差为0.030 µg/kg，最终结果表明莱克多巴胺药物荧光定量快速检测法在牦牛肉中定量限约为0.5 µg/kg。

2.8.2 准确度和精密度的测定

对仪器确证过的空白牦牛肉样本添加样品进行测定，样品添加浓度分别为LOQ、2LOQ、8LOQ，每个浓度添加的样本进行6次平行试验，计算样品添加回收率和批内、批间变异系数[5]。

结果表明，所有样品各添加浓度的回收率均在90.94～111.40%之间。各添加浓度的批内变异系数低于10%、批间变异系数均低于15%。

2.9 阿维菌素的检测

2.9.1 定量限

定量限（LOQ）确定同2.8.1，经测定20个空白牦牛肉样本测定值分别为1.077、1.858、1.314、1.054、0.660、2.135、2.690、2.786、2.309、0.509、2.295、1.407、0.904、2.903、2.782、1.760、1.298、0.522、1.014、2.673 µg/kg,平均值为0.191 µg/kg,标准差为0.030 µg/kg，最终结果表明莱克多巴胺药物荧光定量快速检测法在牦牛肉中定量限约为0.5 µg/kg，最终结果表明阿维菌素类药物荧光定量快速检测卡在牦牛肉中定量限约为10 µg/kg[5]。

2.9.2 准确度和精密度的测定

测定方法同2.8.2，计算样品添加回收率和批内、批间变异系数。结果表明，所有样品各添加浓度的回收率均在93.88～104.94%之间。各添加浓度的批内变异系数低于10%、批间变异系数均低于15%[5]。

3 结论

本研究建立的莱克多巴胺和阿维菌素类药物荧光定量快速检测法检测牦牛肉定量限分别为0.5、10 µg/kg，所有样品各添加浓度的回收率均在90.94～111.40%、93.88～104.94%之 间。各 添加浓度的批内变异系数低于10%、批间变异系数均低于15%[1,2]。