BNIP3在胰腺癌中的表达及其与术后吉西他滨化疗敏感性的关系

王喆，史俊芬，张强，杨尚儒，王昭，荆鑫，李佳幸，池治宣

（1.首都医科大学附属北京朝阳医院 急诊科，北京 100020；2.内蒙古医科大学附属医院 肝胆胰脾外科，内蒙古 呼和浩特 010000）

胰腺癌是恶性程度高、病情发展迅速、预后差的消化系统肿瘤。由于发病初期其临床症状并不明显，发现时大多数已成为晚期，其5 年生存率不足10%[1]。目前手术切除依然是可以根治胰腺癌的治疗方案，但是由于大多数胰腺癌发病时较为隐匿，已经失去了行根治性手术的机会；而对于接受手术的患者来说，手术效果也不尽理想，通常通过术后辅助化疗延长生命，因此手术切除联合术后辅助化学治疗是目前治疗胰腺癌的首选方案[2]。在目前的辅助化疗方案中，应用吉西他滨或者以吉西他滨为主的联合化疗较为普遍。通过术后随访调查发现胰腺癌患者中应用该化疗方案的效果却各不相同，多数是由于肿瘤对吉西他滨类药物产生了耐药性，从而导致化疗效果不佳，影响肿瘤的治疗[3-4]。

Bcl-2/腺病毒E1B-19k相关蛋白3（Bcl-2/E1B-19k-interacting protein 3，BNIP3）属于BH3-only促凋亡蛋白亚类的线粒体蛋白，是一种促凋亡蛋白[5]。BNIP3的分子中含有凋亡效应结构域（BH3结构域）和COOH-末端的跨膜结构区（TM结构区）。通过BH3 结构域，BNIP3 与抗凋亡蛋白结合形成异二聚体，抑制蛋白的抗凋亡功能，继而介导细胞凋亡[6]。而TM结构区位于细胞膜内，具有亲水性的特点，如果缺失会促进缺氧诱导的细胞凋亡[7]。实体肿瘤有个典型的特征—缺氧。低氧环境下，组织细胞发生细胞代谢的改变以及氧化应激损伤，影响了细胞存活的时间。而肿瘤细胞却可以激活生存期适应机制，对抗这种细胞环境从而推进肿瘤的进展[8]。

吉西他滨是二氟核苷类抗代谢药物，具有细胞周期特异性，主要在肿瘤细胞DNA的合成期中发挥作用。在进入细胞后，吉西他滨被脱氧胞苷激酶磷酸化，继而形成双氟脱氧胞苷二磷酸和双氟脱氧胞苷三磷酸活性产物，进一步抑制DNA的合成以及与鸟苷配对，使DNA链合成停止，进而DNA断裂，肿瘤细胞死亡，最后通过胞苷脱氧酶代谢失活[9]。作为胰腺癌化疗的常用药物，在实际应用过程中个体差异明显，对吉西他滨的药物敏感性不同是影响患者总生存时间和无病生存时间的主要因素。有报道称BNIP3的高表达可能会导致胰腺癌对药物治疗的耐药性增大[4]；但也有研究发现BNIP3的高表达与胰腺癌术后应用吉西他滨化疗不佳并不存在关联[10]。

本实验分析内蒙古医科大学附属医院近5 年胰腺癌患者在行手术治疗后应用吉西他滨进行化疗的效果，通过测定肿瘤组织中BNIP3 的表达量，对比使用吉西他滨化疗预后的个体情况，分析BNIP3 的表达量与吉西他滨化疗敏感性之间存在的关联。

1 资料和方法

1.1 一般资料

回顾性分析内蒙古医科大学附属医院2016 年7月至2021年8月共58例胰腺癌根治术患者的临床资料，术后经病理确诊为胰腺癌，病理类型为导管腺癌。共纳入55例免疫组织化学标本，剔除 3例未成功进行免疫组织化学染色。

纳入标准：（1）病理标本适用于免疫组织化学实验；（2）术前并未进行任何形式的化疗及放疗；（3）术后规律应用吉西他滨辅助化疗或以吉西他滨为主的联合化疗；（4）临床资料完整；（5）术后可以进行定期随访。排除标准：（1）有严重基础疾病、肿瘤向远处转移无法完整切除以及行姑息手术者；（2）围手术期出现严重并发症，包括：C级胰瘘、严重腹腔感染、腹腔出血、死亡；（3）患者预期失访可能性大，以及未规律随访或失访。

1.2 免疫组织化学分析及分组方法

根据肿瘤细胞的染色强度及染色范围综合评分。肿瘤细胞的染色强度分4 级，以同一切片中淋巴细胞的染色强度进行标准化。0分：无着色，呈阴性；1分：浅着色，即肿瘤细胞的染色强度低于淋巴细胞；2分：中等着色，肿瘤细胞与淋巴细胞的染色强度相当；3分：强着色，即肿瘤细胞高于淋巴细胞的染色强度。染色范围计分：即根据阳性细胞占所有肿瘤细胞的比例进行评分。0分：阳性细胞或比例＜1%，1 分：≤10%阳性，2 分：11%～25%阳性，3分：26%～50%阳性，4分：＞50%阳性。BNIP3的染色水平评分由染色强度计分与染色范围计分相加而成，阴性：≤2分，弱阳性：3～4分，阳性：5～6分，强阳性：≥7分。将表达阴性及弱阳性判定为BNIP3低表达组，判定阳性及强阳性为BNIP3高表达组。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，正态分布数值以（）表示，计量资料选用t检验或方差分析。计数资料则采取χ2检验，对于期望值小于5的变量，采用Fisher精确检验。用Kaplan-Meier分析总生存时间（overall survival，OS）和无病生存时间（disease free survival，DFS）与BNIP3蛋白水平的相关程度。最后用Cox回归多因素生存分析患者独立预后因素，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同BNIP3蛋白表达水平的胰腺癌根治术患者生存分析

利用Kaplan-Meier法进行生存分析，与BNIP3低表达组比较，BNIP3高表达组的OS [（13（95%CI11.378～14.622）个月vs18（95%CI16.592～19.408）个月]和DFS [7（95%CI4.082～9.938）个月vs14（95%CI12.936～15.064）个月]均降低（P＜0.05）。见图1、2。

图1 BNIP3表达水平和OS的生存曲线

2.2 BNIP3的蛋白表达水平与患者预后的多因素分析

将患者的性别、年龄、民族、长期饮酒、肿瘤位置、肿瘤最大径、病理分化程度、TNM分期、手术方式等资料纳入Cox回归多因素生存分析中。结果显示，胰腺癌组织BNIP3 的表达量（HR0.317，95%CI0.158～0.635）、肿瘤T分期（HR2.314，95%CI1.111～4.820）以及淋巴转移（HR0.282，95%CI0.114～0.696）是OS的独立预后因素（均P＜0.05），见表1。BNIP3的表达量（HR0.272，95%CI0.133～0.559）和淋巴转移（HR0.281，95%CI0.117～0.676）是DFS的独立预后因素（均P＜0.05），见表2。

表1 胰腺癌患者术后OS的单因素及多因素分析

表2 胰腺癌患者术后DFS的单因素及多因素分析

2.3 BNIP3的蛋白表达水平与临床资料的联系

通过对胰腺癌患者临床资料与BNIP3蛋白表达水平的比较（见表3），年龄、肿瘤最大径的差异对于BNIP3的蛋白表达水平未产生影响，差异无统计学意义（P＞0.05）。而性别、民族、肿瘤位置和病理分化程度等因素的不同与BNIP3的蛋白表达水平相比，同样无统计学意义（P＞0.05）。本次实验发现胰腺癌患者的临床资料与BNIP3的蛋白表达水平无相关性，即年龄、性别、民族、肿瘤位置、肿瘤最大径、病理分化程度等暂时不能认为对BNIP3的蛋白表达有影响，BNIP3蛋白表达水平的调控可能与其他因素有关。

表3 胰腺癌BNIP3蛋白表达与胰腺癌患者临床资料比较

图2 BNIP3表达水平和DFS的生存曲线

3 讨论

胰腺癌是致命的恶性肿瘤之一，以手术结合吉西他滨或以吉西他滨为主的联合化疗成为控制并治疗肿瘤进展的主要方案。当能够预测对于吉西他滨的耐药情况时，就会对术后的辅助化疗起关键作用，同时推动个体化方案的进行[11]。本研究发现BNIP3低表达的患者比BNIP3 高表达应用吉西他滨术后化疗具有更佳的临床效果，生存时间更长，可能对药物敏感。同时实验结果表明在对患者一般资料进行分析后，对于应用吉西他滨进行化疗的患者，其OS的独立预后因素包括胰腺癌BNIP3的表达量、分化程度、淋巴结转移，而BNIP3 的表达水平、分化程度是DFS的独立预后因素。对于BNIP3的表达是否会影响应用吉西他滨的获益程度存在着较大的争议，Li等[12]报道BNIP3的高表达与胰腺癌的发生发展有关，BNIP3 低表达的患者有着更高的总生存率。该研究选取70例胰腺癌组织，发现BNIP3表达与肿瘤分期和临床分期参数之间存在统计学差异，其余相关参数与BNIP3的表达无相关性。通过比较胰腺癌患者术后的生存时间与BNIP3表达的关系发现，BNIP3 较低表达的胰腺癌患者术后生存时间较长。淋巴结转移、临床II期和BNIP3较高表达的患者与癌症死亡风险的增加有明显的相关性。多因素分析显示临床分期和淋巴结转移是影响预后的关键因素，BNIP3 表达水平是胰腺癌的独立预后指标。同时Li等[12]通过Western blotting分析发现miR-27a-3p与BNIP3呈负相关，BNIP3的表达减少通过miR-27a-3p激活MAPK信号通路，从而抑制肿瘤生长。本研究也得到了类似的结果，在胰腺癌细胞中BNIP3 的地表达水平可能会给患者带来更长的生存期，同时肿瘤的分化程度也影响着患者的预后。其原因可能是因为BNIP3的蛋白表达水平与肿瘤缺血缺氧的严重程度相关，随着肿瘤坏死的程度增加，其表达水平越高，有待进一步实验验证。

但一些研究对此持相反观点。2005年Akada等[13]的研究中就发现，BNIP3 表达的减少可能与胰腺癌对吉西他滨的耐药性有关。在胰腺癌的细胞株中BNIP3 的表达均呈现不同程度的减少，尤其是在耐药细胞系中，BNIP3 的表达水平下降更明显。实验通过提取胰腺癌患者组织中的mRNA，进行实时定量RT-PCR分析，发现BNIP3 mRNA水平大部分低于正常对照组织，在进行Western blotting实验后证实BNIP3 的siRNA抑制了BNIP3 的表达，进而降低吉西他滨对胰腺癌细胞的细胞毒性，在胰腺癌细胞系模型中通过发挥PI3K/Akt通路在吉西他滨耐药中的作用展示了BNIP3 对吉西他滨敏感性的影响。BNIP3表达的降低最终增加了对吉西他滨的耐药性，显著降低了胰腺癌患者的生存率。但由于在该实验中仅提取了部分患者的胰腺癌组织，考虑到样本数不足，会存在选择偏倚。但对患者术后未进行规律性随访，对于术后存活时间无明显对比。Erkan等[14]的研究结果表明BNIP3的低表达的患者具有较短的生存期。随后通过研究吉西他滨对BNIP3修饰细胞的细胞毒作用，结果发现BNIP3 的沉默表达通常与化疗耐药的增加有关。在胰腺癌晚期，BNIP3 的丢失可能会产生更具侵袭性的肿瘤表型，并且至少在一定程度上促成了这种恶性肿瘤的化疗耐药。而在Okami等[15]的进一步研究中，发现BNIP3 是胰腺癌的肿瘤抑制因子，同时研究表明BNIP3 的低表达是胰腺癌细胞适应缺氧条件的一种分子机制。在缺氧条件下，诱导BNIP3 的表达使胰腺癌细胞对缺氧更加敏感，BNIP3 在胰腺癌中的频繁失活及其作为凋亡诱导物的作用支持了该分子作为肿瘤抑制因子的作用。这可能是由于BNIP3低表达的肿瘤细胞对诱导凋亡的敏感性降低所致。因此，BNIP3 高表达的胰腺癌患者具有较高的总生存率[4]

胰腺癌患者术后使用吉西他滨化疗的BNIP3蛋白低表达比BNIP3高表达的患者有更长的总生存时间和无病生存时间，对吉西他滨药物更加的敏感。BNIP3可作为胰腺癌术后应用吉西他滨疗效的预测性标志物，从而为患者选择更好的化疗药物。BNIP3在胰腺癌中的表达程度和病理分化程度无关联，但两者共同影响OS和DFS。在胰腺癌中BNIP3的表达调控机制复杂，其相关机理以及影响因素仍然需要进一步深入研究。