酶法辅助乙醇提取废次烟叶绿原酸的工艺研究

陈月星，黄金辉，阎佩云，张晓虎

（1.商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000；2.陕西秦岭特色生物资源产业技术研究院，陕西 商洛 726000；3.陕西省烟草公司商洛市公司洛南县分公司，陕西 商洛 726100）

绿原酸在国际上被公认为“植物黄金”［1］，具有多种生物活性与药理活性［2-4］，广泛应用于医药保健和食品加工等各个领域。绿原酸（Chlorogenic Acid）分子式为C16H18O9，分子质量为354.30 Da，含有羟基和邻二酚羟基，由咖啡酸与奎尼酸组成的缩酚酸，又名咖啡鞣酸或咖啡单宁酸［5］，广泛存在于各类植物组织中［6-9］。

烟叶绿原酸主要包含绿原酸（3-O-咖啡酰奎尼酸）、隐绿原酸（4-O-咖啡酰奎尼酸）、新绿原酸（5-O-咖啡酰奎尼酸）［4，10］。中国是烟草大国，烟草栽培、烘烤及卷烟生产过程中会产生大量的低废次烟叶，目前主要采用就地焚烧、掩埋或堆弃等方法进行处理，导致严重的环境污染和资源浪费等生产生态问题［11］。以往科研工作者对烟草绿原酸的基因表达进行了较深入的研究，取得了一定的进展［12-15］，但是有关绿原酸的提取和纯化工艺研究还较少。

目前，植物中绿原酸的提取方法主要包括微波辅助提取法、溶剂提取法和超声波辅助提取法［16-18］，对于同一植物材料，如何快速而高效地提取其中所含绿原酸是提取的关键问题。细胞壁是植物细胞外围的一层特殊组织，主要成分为纤维素和果胶。选用适量的纤维素酶和果胶酶等可以破坏细胞壁的构造，从而使得细胞壁内的有效成分溶出，王轩等［6］采用水提法和生物酶解法比较蒲公英中绿原酸的提取效果，发现酶解法较水提法更好。邓爱华等［19］采用酶法辅助法提取杜仲中的绿原酸，发现适量应用纤维素酶可显著提高绿原酸的提取率。基于此，本研究以废次烟叶为原料，在溶剂提取法基础上添加适量的纤维素酶，并通过单因素试验分析各因素对绿原酸提取率的影响，选取影响较大的因素进一步通过响应面试验对提取工艺进行优化，以期利用纤维素酶对细胞壁的分解作用提高绿原酸提取效率，推动废次烟叶的再利用，促进烟草产业的可持续发展。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

材料：废次烟叶（商洛市烟草公司提供）。

试剂：无水乙醇、3，5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、纤维素酶（食品级）等。

仪器：BS-15A型电子秤，YB-500A型粉碎机；HH-4型数显恒温水浴锅；R-501型旋转蒸发器；7225B型紫外可见分光光度计；DZF-6020型真空干燥箱等。

1.2 方法

1.2.1 原料预处理将适量的废次烟叶，首先冲洗干净，把水控干，置于68℃烘箱中干燥2.0 h，然后取出粉碎过60目筛，保存于标记好的密封塑料袋备用［20］。

1.2.2 绿原酸的提取称量10 g预处理后的烟叶粉末放入烧杯中，边搅拌边加入250 mL的去离子水，搅拌0.5 h，搅拌均匀后加入2%的纤维素酶，在55℃水浴锅中恒温加热1.5 h进行酶解反应，真空抽滤，称取残渣5 g于250 mL锥形瓶中，加入一定比例的无水乙醇，设置温度，在超声波清洗仪中溶解浸泡一段时间，将样液在4 000 r/min条件下离心30 min，取上清液于旋转蒸发仪蒸发浓缩至无乙醇味，即为绿原酸粗品［7］。

1.2.3 绿原酸标准曲线的绘制准确称取绿原酸标品，将其配置成1 mg/mL的标准溶液进行待测，分别吸取标准液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL置于50 mL的圆底烧瓶中，使用移液管将去离子水加入至刻度线附近，再滴入3 mL的3，5-二硝基水杨酸（DNS）溶液，将配置好的溶液放于沸水中显色处理5 min后取出，然后在冷水中迅速冷却至室温状态，加去离子水至刻度线，振荡混匀后在330 nm波长处测定吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，绿原酸浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线并进行验证试验。

1.2.4 绿原酸提取率的测定按照标准曲线回归方程，在波长330 nm的条件下进行测定，通过以下公式计算提取率［19］。

式中，C为样品中绿原酸含量（mg/mL）；N为稀释倍数；V为绿原酸提取样液体积（mL）；M为原料的质量（g）。

1.2.5 单因素试验在“1.2.2”方法的基础上，对以下因素进行考察，控制其他条件不变，分别考察浸泡温度（50、55、60、65、70℃）、浸泡时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、浸提温度（70、80、90、100、110℃）、料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，m/V，下同）对烟叶中绿原酸提取率的影响，利用紫外分光光度计进行比色测定含量，计算得出绿原酸提取率。

1.2.6 响应面试验根据单因素的试验结果与分析，选择对绿原酸提取率影响显著的因素进行响应面优化试验，依据Box-Behnken中心组合试验设计的原理，以绿原酸提取率为响应值，进行响应面优化试验，确定最优的提取工艺参数［21］。

1.2.7 验证试验对模型预测的最佳工艺条件进行验证，重复3次取平均值，与模型预测值进行比较，验证所得工艺的准确性和可重复性。

2 结果与分析

2.1 绿原酸标准曲线

以吸光度值（A）为纵坐标，绿原酸浓度（μg/mL）为横坐标，绘制绿原酸标准曲线（图1），得到线性回归方程为y=0.111 5x-0.010 9，R2=0.989 1，表明在0˜ 18 μg/mL水平上绿原酸质量浓度和吸光度具有良好的线性关系。

图1 绿原酸标准曲线

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 浸泡温度浸泡温度对废次烟叶中绿原酸提取率的影响如图2所示，浸泡温度为55℃时，绿原酸提取率最高，此后随着浸泡温度的升高，提取率逐渐下降，因为酶的催化作用受温度的影响，当温度超过酶的最适反应温度时，其空间构象会发生改变，使得酶活性降低，影响酶促反应速率。在55℃时绿原酸提取率最高（25.4 mg/g），且极显著高于其他处理（P＜0.01），故考虑选用浸泡温度50˜60℃为响应面的优化条件。

图2 浸泡温度对废次烟叶绿原酸提取率的影响

2.2.2 浸泡时间浸泡时间对废次烟叶中绿原酸提取率的影响如图3所示，结果表明，随着浸泡时间的延长，废次烟叶中绿原酸提取率呈逐渐增加的趋势，但是当浸提时间超过1.5 h时绿原酸提取率增加缓慢，且当浸泡时间为2.0、2.5 h时，其绿原酸提取率与浸提时间1.5 h差异不显著（P＞0.05），故选用浸泡时间1.0˜2.0 h为响应面的优化条件。

图3 浸泡时间对废次烟叶绿原酸提取率的影响

2.2.3 浸提温度浸提温度对废次烟叶中绿原酸提取率的影响如图4所示，结果表明，在70˜90℃时，随着浸提温度的升高，废次烟叶中绿原酸提取率逐渐增加，当浸提温度为90℃时，绿原酸提取率最高为25.2 mg/g，且极显著高于其他处理（P＜0.01），当提取温度为80、100℃时，绿原酸提取率之间的差异未达到显著水平，故选用浸提温度80˜100℃为响应面的优化条件。

图4 浸提温度对废次烟叶绿原酸提取率的影响

2.2.4 料液比料液比对废次烟叶中绿原酸提取率的影响如图5所示，结果表明，随着提取液比例的增大，废次烟叶中绿原酸提取率呈先升高后降低的趋势，当料液比为1∶25时，绿原酸提取率最高为25.1mg/g，且与其他处理差异极显著（P＜0.01），故选用料液比1∶20˜1∶30为响应面的优化条件。

图5 料液比对废次烟叶绿原酸提取率的影响

2.3 响应面试验

2.3.1 响应面试验设计单因素试验结果分析显示，所考察的4个单因素均显著影响废次烟叶绿原酸提取率，因此这4个因素全部进入响应面试验进行优化，响应面试验因素和水平如表1所示。

表1 响应面试验因素和水平

2.3.2 响应面试验结果及分析响应面试验结果如表2所示，其中第29处理组合（A0B0C0D0）绿原酸提取率最高，为25.87 mg/g。

表2 响应面试验结果

对响应面试验结果进行回归分析，以绿原酸提取率作为响应值，采用Design-Expert 8.0软件对各试验因素进行回归拟合，得到回归方程式为Y=25.70+0.62A-0.14B+0.74C+0.47D-0.33AB-0.077AC-0.26AD-0.79BC-1.08BD-0.14CD-1.24A2-2.47B2-2.85C2-7.13D2。

对回归方程进行显著性检验，结果如表3所示，P＜0.01，失拟项P＞0.05，说明回归方程显著，具有统计学意义。此外，浸泡时间（A）和料液比（D）对对绿原酸提取率影响显著（P＜0.05），浸提温度C、A2、B2、C2和D2对绿原酸提取率影响达到极显著水平（P＜0.01），浸泡温度B和料液比D的交互作用达到显著水平（P＜0.05）。各因素对废次烟叶中绿原酸的提取率的影响程度为浸提温度（C）＞浸泡时间（A）＞料液比（D）＞浸泡温度（B）。

表3 回归模型方差分析

响应面分析结果显示，最佳工艺条件为浸泡时间1.46 h，浸泡温度55.68℃，浸提温度92.5℃，料液比为1.00∶25.16，预测提取率为25.809 mg/g。

2.4 验证试验

为了便于试验操作，将响应面优化工艺参数设置为浸泡时间1.5 h，浸泡温度55℃，浸提温度92℃，料液比1∶25，此结果与响应面试验第29处理组合基本一致。依此工艺参数进行3组验证试验，取其平均值，绿原酸提取率为25.863 mg/g，与预测值（25.809 mg/g）基本一致。

3 讨论与结论

缩酚酸中咖啡酸的羧基和奎尼酸的羟基是构成绿原酸的主要成分，也是植物组织细胞中通过莽草酸过程组合的一种名为苯丙素类的物质，其中结构式中含有邻二酚羟基、酯键、不饱和双键及多元酚［17］，因此，在进行单因素的提取试验中，绿原酸的化学性质不稳定，导致浸提温度的控制需掌握到最佳，长时间的高温环境致使分解严重，损失率逐步上升。在热提过程中，由于绿原酸属于多酚，而多酚可能会和蛋白质、多糖、果胶等物质形成沉淀物析出［18］。因此，在浸提温度上要严格把控，试验证明，浸提温度在90℃将达到最佳状态。进一步通过响应面试验对4个因素进行优化，得到最佳工艺参数为浸泡时间1.5 h，浸泡温度55.5℃，浸提温度92℃，料液比1∶25，该条件下绿原酸提取率为25.863 mg/g，本试验的工艺条件提取绿原酸简便快速、绿色环保、效率高，可为废次烟叶的综合利用提供理论依据。

此外，绿原酸与烟草质量和抗逆性紧密相关，已引起许多研究者的重视［22］，但是烟株各组织部位绿原酸含量各不相同，提取方法也不同，如何高效快速地提取烟株中的绿原酸，以及如何提高其纯度有待进一步研究。