青稞酒糟中蛋白质的提取工艺

樊世萌，刘浩，欧阳敬禹，2，刘恋，尤祥宇，2，苏江涛，2，肖红卫

（1.湖北工业大学生物工程与食品学院，武汉 430068；2.襄阳湖北工业大学产业研究院，湖北 襄阳 441100；3.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎工程与分子育种湖北省重点实验室，武汉 430072）

青稞是一种禾本科大麦属的禾谷类作物，广泛种植于中国青藏高原地区。青稞具有很高的淀粉含量，适用于酿酒，因此每年都会产生大量青稞酒糟。青稞酒糟中含蛋白质、氨基酸等大量营养成分，可加以利用，避免资源浪费［1］。目前对酒糟的利用主要是用作动物饲料［2］、作物肥料［3-5］、提取有效成分［6］、栽培食用菌［7］等方面。青稞酒糟中的蛋白质以醇溶蛋白所占比例最高。醇溶蛋白是谷物中的一种贮藏蛋白［8］，具有很好的耐水性、耐热性，被广泛应用于食品、医药、精细饲料等［9-11］领域。对青稞酒糟中蛋白质的提取，有利于拓展青稞酒糟的应用，提高其附加值。

目前，提取醇溶蛋白最有效的方法是醇碱法，但是除了选取适合的溶剂外，浸提液醇碱比、固液比、浸提时间和浸提温度都会显著影响提取效率。虽然关于酒糟中蛋白质的提取已有报道，但是关于青稞酒糟中蛋白质的提取工艺报道很少。近年来青稞酒糟的产量越来越大，因此探究青稞酒糟蛋白质的最佳提取工艺，对综合利用青稞酒糟具有十分重要的意义。本试验在单因素试验的基础上，选取了浸提液醇碱比、固液比、浸提时间和浸提温度为影响因子，采用4因素3水平的正交试验，以蛋白质提取率作为指标，确定了青稞酒糟蛋白质的最佳提取工艺条件。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

材料与试剂：青稞酒糟，来源于湖北工业大学酿酒基地；氢氧化钠、盐酸、95%乙醇等均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；试验用水均为实验室自制去离子水配制。

仪器：FE20型pH计，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；H1850R型台式高速冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司；DYZ-20型低温恒温摇床，常州市金坛博科实验设备公司；SKD-1000型全自动凯氏定氮仪，上海沛欧分析仪器有限公司；101-1AB型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；UPT-I-10T型超纯水仪，四川优普超纯科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 原料预处理新鲜青稞酒糟在电热鼓风干燥箱中90℃烘干，粉碎，过40目筛，得到试验原料。

1.2.2 青稞酒糟中蛋白提取工艺步骤试验原料→95%乙醇和0.5 mol/L氢氧化钠混合提取剂→搅拌浸提→7 000 r/min、4℃离心10 min→上清液→酸沉→冷冻离心→沉淀→干燥→粉碎→青稞酒糟蛋白粉。

1.2.3 青稞酒糟中蛋白质含量的测定采用凯式定氮法测定青稞酒糟中的蛋白质含量。

1.2.4 青稞酒糟中蛋白质沉淀最适pH的测定利用蛋白质在其等电点下溶液中溶解度最低的特点，测定青稞酒糟中蛋白质的等电点即为青稞酒糟沉淀蛋白质的最适pH。

称取1 g试验原料，加入28 mL 0.5 mol/L氢氧化钠溶液和14 mL 95%乙醇，30℃下浸提90 min，控温摇床转速设置为30 r/min，浸提结束后，离心分离取上清液备用，上清液平均分成10份（每份40 mL），分别用盐酸调节浸提液pH至5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6，调酸后浸提液体积均略有增加，各取40 mL，7 000 r/min、4℃离心10 min后弃去上清液，将沉淀物置于90℃烘箱内干燥4 h，称重干燥物。按照上述条件重复3次，将干燥物重量与沉降pH关系绘制成曲线图，干燥物重量最大时的沉降pH即为青稞酒糟沉淀蛋白质的最适pH。

1.2.5 青稞酒糟中蛋白质提取工艺优化首先利用单因素试验对影响青稞酒糟蛋白质提取率的固液比、浸提液醇碱比、浸提时间、浸提温度4个主要因素进行考察分析，再进行4因素3水平的正交试验进行优化。

1.2.6 青稞酒糟蛋白质提取率的计算蛋白质纯度指凯式定氮法测得的干燥物中蛋白质含量占干燥物的百分比，蛋白质提取率指凯式定氮法测得的干燥物中蛋白质含量占投料的试验原料中蛋白质理论含量的百分比。

2 结果与分析

2.1 沉淀青稞酒糟蛋白质的最适pH

经过凯式定氮法测定，干燥的青稞酒糟中蛋白质含量占比19.1%，蛋白质含量比例很高，说明青稞酒糟具有很大的利用潜力。通过查阅文献了解到，沉降酒糟蛋白质的最适pH大多数在4.5˜5.5，因此本试验设置pH梯度为4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5。图1为在不同沉降pH下得到干燥物的量，由图1可知，青稞酒糟沉淀蛋白质pH为4.9时，干燥物质量最大。因此，在后续的单因素试验中，沉淀青稞酒糟蛋白质的pH设置为4.9。

图1 青稞酒糟蛋白质最佳沉淀pH的确定

2.2 单因素试验

2.2.1 固液比对蛋白质提取率的影响称取青稞酒糟原料7份，每份1 g，置于标号1—7的锥形烧杯中，分 别 按 照 固 液 比1∶20、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶60，加入浸提液（95%乙醇∶0.5 mol/L氢氧化钠溶液=1∶2），在30℃下浸提90 min，探讨固液比对蛋白质提取率的影响。由图2可知，青稞酒糟蛋白质提取量随着浸提液体积的增大而增加，当固液比为1∶45时，蛋白质提取率最高，为46.93%；但是当继续增加浸提液体积，蛋白质提取率不升反降。说明过量的浸提液反而会影响后续蛋白质的沉淀，导致蛋白质提取率下降。因此使用醇碱法提取青稞酒糟蛋白时，最佳固液比为1∶45。

图2 固液比对蛋白质提取率的影响

2.2.2 浸提液醇碱比对蛋白质提取率的影响将浸提液醇碱比（95%乙醇∶0.5 mol/L氢氧化钠溶液）分别设置为1∶1、2∶3、1∶2、1∶3、1∶4；称取青稞酒糟原料5份，每份1 g，置于标号1—5的锥形烧杯中，各加入45 mL上述浸提液，30℃下浸提90 min，探讨浸提液醇碱比对蛋白质提取率的影响。由图3可知，青稞酒糟蛋白质提取率随着浸提液中碱液比例的增加而增加，当醇碱比为1∶3时，蛋白质提取率最大，为49.82%；但是当继续增加浸提液中碱液比例，蛋白质提取率降低。可能的原因是，虽然进一步增加浸提液中碱液比例，可使析出物增加，但是析出物颜色加深，说明析出物中不仅含有蛋白质，还可能含有纤维素等成分，对蛋白质的纯度产生了影响，降低了蛋白质的提取率。因此使用醇碱法提取青稞酒糟蛋白质时，提取液最佳醇碱比为1∶3。

图3 浸提液醇碱比对蛋白质提取率的影响

2.2.3 浸提温度对蛋白质提取率的影响称取青稞酒糟原料4份，每份1 g，置于标号1—4的锥形烧杯中，在固液比1∶45，醇碱比1∶2，浸提时间90 min的条件下，浸提温度分别设置为4、30、37、45℃，探讨浸提温度对蛋白质提取率的影响。由图4可知，浸提温度为30℃时的蛋白质提取率显著高于浸提温度为4℃时的蛋白质提取率；而当浸提温度超过30℃，蛋白质提取率并没有显著的增加。分析原因可能是，随着温度的提升，分子运动速度加快，更容易从试验原料中析出；但是温度过高也可能导致其他杂质的析出增加，还可能导致蛋白质变性，影响蛋白质的纯度；同时过高的温度会增加能耗成本。因此在提取工艺中，最佳的浸提温度为30℃。

图4 浸提温度对蛋白质提取率的影响

2.2.4 浸提时间对蛋白质提取率的影响称取青稞酒糟原料5份，每份1 g，置于标号1—5的锥形烧杯中，在料液比1∶45，醇碱比1∶2，浸提温度30℃的条件下，浸提时间分别设置为30、60、90、120、180 min，探讨浸提时间对蛋白质提取率的影响。由图5可知，随着浸提时间的增加，蛋白质提取率逐步提高，当浸提时间为90 min时，提取率最大，为46.85%；但是进一步延长浸提时间，提取率下降。分析其原因可能是，浸提时间过短，蛋白质析出不充分；而浸提时间过长可使部分蛋白质发生变性后的絮凝作用，导致提取率下降。因此，在提取工艺中，最佳浸提时间为90 min。

图5 浸提时间对蛋白质提取率的影响

2.3 正交试验

在4个单因素试验的基础上，再进行正交试验的设计，试验设计见表1，具体的正交试验结果见表2。

表1 青稞酒糟蛋白质提取的正交试验因素与水平

由表2可知，各因素对青稞酒糟蛋白质提取率的影响强弱为固液比＞醇碱比＞浸提温度＞浸提时间。以青稞酒糟蛋白质的提取率为主要的参考指标进行极差分析后，确定理论最优组合为A2B1C3D2，但考虑到实际生产条件与经济成本，确定实际最优组合为A2B1C2D3。因此，青稞酒糟的最佳提取条件为固液比1∶45，醇碱比1∶3，浸提温度30℃，浸提时间90 min，青稞酒糟蛋白质提取率为50.24%，干燥物中蛋白质纯度为29.4%。

表2 青稞酒糟蛋白质提取的正交试验结果

3 小结

本试验采用醇碱溶解、酸沉的提取工艺对青稞酒糟蛋白质进行提取，所得到的青稞酒糟干燥物磨成粉后，颜色为浅黄色，粉末颗粒均匀，影响青稞酒糟蛋白质提取率的因素顺序为固液比＞醇碱比＞浸提温度＞浸提时间，最佳提取条件为固液比1∶45，醇碱比1∶3，浸提温度30℃，浸提时间90 min，所得青稞酒糟蛋白质提取率为50.24%，干燥物中蛋白质纯度为29.4%。本试验验证了使用醇碱法提取青稞酒糟蛋白质的可行性，蛋白质提取率较高，虽纯度有待进一步提升，但提取条件温和、简易，为在工业上大规模提取青稞酒糟的蛋白质提供了参考，对青稞酒糟的综合利用具有一定参考意义。