广西莪术优良种质单株产量和挥发油含量的聚类分析

杨妮，谢巍，王建

（1.柳州市妇幼保健院（广西科技大学附属妇产医院、儿童医院），广西 柳州 545001；2.广西中医药大学药学院，南宁 530001）

广西莪术（Curcuma kwangsiensis）为姜科姜黄属植物，以干燥根茎入药，其味辛、苦，性温，具有行气破血、消积止痛的作用［1］。现代研究发现，广西莪术中可分离得到多种化学成分，主要包括挥发油类和姜黄素类化合物，具有抗肿瘤、抗血小板聚集、抗血栓、调血脂、抗炎镇痛、降血糖、抗氧化等多种药理作用，具有良好的临床应用前景［2，3］。目前国内外学者对广西莪术的研究主要包括药用良种选育、药用栽

培、化学成分、药材质量控制、药理作用、观赏园艺等方面［4-9］。杨妮等［4］、王建等［5］对广西莪术良种选育、植株形态学、药材性状、成分分析进行了研究。为进一步选育优良广西莪术种质资源，本研究以不同种质广西莪术的产量、挥发油含量及成分为评价指标，采用系统聚类法对产量及挥发油含量高的种质进行分析，为建立广西莪术品种选育提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

FA1004型电子天平（上海精科天平仪器厂），98-1-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司），挥发油提取器，Agilent 7890N/5975NGC-MS型联用仪（美国安捷伦）；超声仪；LG16-W型离心机（北京京立离心机有限公司）；试剂均为国产分析纯。药材采自广西玉林、兴业、钦州、灵山、贵港、桂平、平南、青塘、横县、邕宁、金秀等地，经广西中医药大学王建教授鉴定为姜科植物广西莪术，不同种质材料共计150份，按照植物学性状（株高、叶长、叶宽、叶面有无被毛）及药材性状进行分类编号，集中种植于广西南宁市仙葫种植基地，并统一栽培管理，保证了除种质本身存在差异外其他条件（栽培基地条件、气候条件、田间管理、施肥种类、施肥时间与数量等）完全一致，连续种植繁育6年，保证非处理因素的一致性。

1.2 方法

1.2.1 产量测定将成熟后采收的不同种质的广西莪术材料共150份，置于通风庇荫处存放2 d，风干表面泥沙，防止发霉变质。用枝剪剪去须根，分离出莪术（Curcuma aeruginosaRoxb.）和郁金（Curcuma rcenyujinY，H.Chenet C.Ling），其次用刷子刷去莪术和郁金表面的泥沙及顶端枯叶，为准确测量数据做准备，并对每个材料的药材性状进行详细记录。将上述清理干净的药材进行准确称量，天平称定单株莪术药材重量。

1.2.2 挥发油提取将上述称重后材料中单株莪术重量大于150 g的材料取出备用。提取试验方法参照《中国药典》（2015版）四部通则中挥发油测定法，分别取不同种质广西莪术当选株系的根状茎洗净、晾干，每份取鲜品100.0 g，切碎。置于1 000 mL圆底烧瓶中，加水500 mL，加热煮沸并保持微沸7 h，待冷却静置分层后读取挥发油体积，并收集挥发油置于2 mL离心管中保存，计算得油率，挥发油得油率=（V/m）×100%，其中，V为提取挥发油体积（mL）；m为药材质量（g）。含油量≥0.5 mL/100 g的种质被认定为含油量高种质。1.2.3挥发油成分GC-MS分析样品预处理：取挥发油约0.05 mL，加入甲醇稀释至约1.5 mL，超声5 min后取出，加入无水硫酸钠适量除去水分，离心10 min，取出备用。

GC-MS测定条件：色谱柱为HP-5MS（30 m×0.32 mm×0.25 μm）。升温程序为初始60℃（4 min），以10℃/min升温至100℃，再以4℃/min升温至108℃，保持2 min，以4℃/min升温至156℃，保持10 min，以20℃/min升温至280℃，保持2 min；气化温度250℃，检测器温度280℃；载气为高纯氦气；载气流量1.5 mL/min；进样量1 μL；分流比50∶1；溶剂延迟3 min。质谱条件：电子轰击（EI）电离源，电子能量70 eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃；图谱库为NIST08。

1.2.4 挥发油成分聚类分析系统聚类分析，可以将多个样本按照设定的距离聚成新的一类，操作较为简便且结果直观。利用SPSS 22.0统计软件包中的聚类分析程序分别以莪术挥发油产量及颜色、莪术挥发油成分为指标对筛选出的优质药材进行聚类分组。采用Z-score法对原始数据进行标准化转换。其中，式中，为各变量的算术平均值1，2，…，p），Sj为标准差，n为样本点个数，p为自变量的个数；Zij为标准化后的变量值；xij为实际变量值。经过标准化处理的变量权重相同，均值为零，方差为1。

2 结果与分析

2.1 高产量种质材料统计

对150份材料产量数据进行分析，其中有39个材料单株莪术重量＞200 g，被初步认定为产量高的优良种质材料。其中，玉9/B56的产量最高，单株莪术重量达1 343.0 g，玉8/A81产量次之，单株莪术重量达916.0 g。莪术单株重量＞500 g的材料有13个，这些材料在产量方面表现出其种质的优越性（表1）。

表1 39个高产量种质材料含油量及产量统计

2.2 高油量种质材料统计

筛选单株莪术重量大于150 g的种质材料共51份，进行挥发油提取，统计挥发油出油率。51份材料中发现有21份材料挥发油的含量≥0.5 mL/100 g，研究认定为含油量高的材料，其中，玉18/B97挥发油含量最高，达1.41 mL/100 g，玉11/A28含油量次之，为1.32 mL/100 g，含油量≥0.90 mL/100 g的材料有10个，这些种质在含油量方面表现出种质的优越性（表2）。

表2 21个高油量的种质材料含油量及产量统计

2.3 高产量和高油量材料统计

选取挥发油含量≥0.5 mL/100 g，且单株莪术重量≥400 g以上的种质材料，认定为产量和含油量均高的材料。产量和挥发油均高的材料有18个，其中，玉18/B97、玉11/A28的挥发油含量较高，分别达1.41、1.32 mL/100 g，同时其单株莪术药材重也较高，分别达416.5、307.0 g，是表现优良的种质（表3）。

表3 18个高产量和高油量种质材料含油量及产量统计

2.4 GC-MS检测结果

对“2.3”筛选的18个高产量和高油量种质材料进行挥发油成分分析，吸取离心后的挥发油1 μL进行分析测定。通过GC-MS分析，得出18个优良种质广西莪术鲜品挥发油的质谱图，通过化学工作站数据系统分析，按峰面积归一化法进行计算求得各化学成分在挥发油中的相对百分含量。通过NIST08标准图库进行检索，选取匹配度SI＞90%的化合物，结合有关文献进行人工检索和解析，确认各化合物，共鉴定出36个化合物（表4）。

表4 18个高产量和高油量材料挥发油成分GC—MS分析

2.5 广西莪术挥发油产量及颜色聚类分析

以挥发油产量及颜色为变量，对18个种质进行聚类，可分为3类（表5），其中1类有8个品种，单株重量为500 g，挥发油多为紫褐，偶有紫灰色；Ⅱ类有7个品种，单株重量为800˜900 g，挥发油多为黄色，偶有浅黄色；Ⅲ类有3个品种，单株重量为400˜600 g，挥发油多为浅黄色和黄色。

表5 18个高产量和高油量材料挥发油产量及颜色聚类分析

2.6 挥发油成分的聚类分析

利用SPSS 22.0聚类分析软件，先对全部数据进行统一标准化处理，再利用标准化后的数据进行聚类分析。分别筛选特征性组分，以不同的成分为变量进行分析。由图1可以看出，以全部成分为变量时所得成分聚类分为2类，玉14/C29、C108、玉11/A28、玉13/C106、玉18/B97、药用2、A28聚为一类；广城1、玉10/A12、药圃、C39、C105、C16、玉6/C84、玉22、玉1/C59、玉17/B6、玉4/B81聚为一类。

图1 以挥发油所有成分为变量所得成分聚类分析

3 小结与讨论

3.1 不同种质广西莪术药材产量及挥发油含量比较

150份研究材料产量及挥发油含量统计结果显示，不同种质产量及挥发油含量均存在一定差异，其中，玉9/B56、玉8/A81等13个材料在产量方面表现出其种质的优越性，莪术单株重量＞500 g；挥发油提取数据可得出21份材料挥发油的含量≥0.5 mL/100 g，其中，玉18/B97、玉11/A28的材料含油量较高，后期应继续关注成分分析研究。

3.2 产量及挥发油均高的广西莪术优良种质筛选

根据2015年版《中国药典》规定，莪术干品含挥发油≥1.5%（mL/g）。莪术折干率5∶1，因此莪术鲜品挥发油应≥0.3%（mL/g），故认为广西莪术鲜品每100 g中挥发油提取量≥0.3 mL的样品为优质品种。研究发现，产量及挥发油含量均高的种质共18种，主要包括玉18/B97、玉11/A28、药圃等。其中，玉11/A28为长势好、含油量及产量高的优质品种，与其归为一类的莪术具有以下特征：挥发油颜色多为紫褐，偶有紫灰色；挥发油含量较高，可达1.2 mL/100 g，药材单株质量500 g。

3.3 挥发油成分差异比较

对产量及挥发油均高的18个广西莪术种质进行GC-MS挥发油成分分析，发现共有成分樟脑、β-榄香烯、莪术烯、龙脑含量差异较大，各样品色谱图的有效成分出峰时间基本相同，但因所含的成分各不相同，每个样品的色谱峰均有差异。其中有效成分莪术烯、β-榄香烯均能检测到，而重要有效化学成分吉马酮，依据匹配度SI＞90%进行检索，并未检索到吉马酮，可能由于挥发油提取过程中保存不当损失所致。根据以上结果分析，综合单株产量、挥发油得油率、有效成分相对含量3个方面考虑，A28、玉14/C29、玉18/B97、玉11/A28、药用2、C39在所有样品中品质较优，该分析结果可为后期选育优良种质试验提供依据。

3.4 聚类分析在优良种质筛选研究中的可行性

选育优良种质资源时，需对所有样本进行初步梳理与确认，本研究涉及样本较多，聚类分析法可进行品种的归类，从而选育出每一类中的优良品种，同时综合多个不同侧重点的数据筛选出长势好、产量高、含油高的品种；成分聚类分析是中药材质量标准制定的有力手段，通过聚类分析的方法可初步筛选出含有不同有效成分的广西莪术品种，临床应用时可选择有效成分含量高的种质材料，保障临床治疗效果，减少药材损耗量；同时聚类分析结果可为良种选育提供必要的参考依据，可初步判定不同种质广西莪术亲缘关系的远近，进行良种选育时可选择亲缘关系较远的品种进行杂交，提高种内变异，有助于在种内传递性状优良的遗传基因。