微波辅助法提取构树叶总黄酮工艺优化研究

王述柏，蔡晴霞，王建琳，邵 坤，张林林，单 虎，郭 沛，秦志华*

(1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109)

近年来构树在我国种植面积广，枝叶产量高，因其营养丰富在畜禽养殖中作为饲料资源得到了广泛应用。有研究表明，构树根皮、枝叶等部位中含有丰富的黄酮类化合物、生物碱、多糖等生物活性物质，具有抗真菌、抗病毒、抗肝细胞毒、抗氧化、抑制酪氨酸酶和α-葡萄糖苷酶活性等生理作用，可用于治疗真菌感染、癌症、糖尿病等疾病，功效主要与其黄酮类成分有关。构树入药最早记载于《名医别录》，用于治疗水肿、痢疾等病症，可见构树除具有较高的营养价值外，亦有较高的药用价值。对构树中具有药用活性的物质如黄酮类等进行提取及在畜禽疾病防控中合理利用具有重要的实践应用价值。

植物中黄酮类化合物的提取常用微波辅助提取法、加热回流提取法等。微波辅助提取法具有选择性强和高效性等特点，相较于加热回流法反应时间可节省50%～90%；加热回流提取法主要使用乙醇等有机溶剂对样品中的有效成分进行提取，反应时间较长，有利于样品与溶剂充分接触使目标物质充分浸出，但因反应时间过长、温度过高易使有效成分失活。目前有关构树中黄酮类等生物活性物质的提取技术研究报道较少。该试验采用单因素和正交试验设计研究了采用微波辅助法提取构树叶总黄酮的最优提取工艺，旨在探讨构树叶总黄酮的高效、低成本提取工艺条件，从而为其在畜禽健康养殖中的开发利用提供科学方法。

1 材料与方法

主要试剂。构树叶粉末(过40目筛)；芦丁标准品(索莱宝生物科技有限公司)；无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸盐、氢氧化钠(分析纯，天津恒兴化学试剂制造有限公司)。试验在青岛农业大学动物医学院实验室，于2017年5—7月进行。

主要仪器。AR2140电子分析天平(上海奥斯豪国际贸易公司)；XH-100A微波催化合成/萃取仪(北京祥鹄科技发展有限公司)；WFZ754型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；KDM电子调温电热套(龙口市先科仪器有限公司)。

芦丁标准曲线的绘制。芦丁标准品加少量无水乙醇溶解，70%乙醇溶液定容，即得芦丁标准品溶液。根据NaNO-Al(NO)-NaOH比色法检测510 nm下不同浓度芦丁标准品溶液的吸光度。以芦丁质量浓度(mg/mL)为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得出回归方程为=10623-0003 5(=0999 4)。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

微波辅助提取法提取工艺条件筛选。采用单因素试验设计，分别对提取时间、提取温度、微波功率、料液比、乙醇浓度5个因素设置5个水平，以总黄酮提取量为评价指标，筛选最优条件。

(1)提取时间。提取时间分别设置为3、5、7、9、11 min，其他提取条件一致，即以50%乙醇为溶剂，料液比为1∶20(g∶mL)，提取温度为55 ℃，微波功率设置为400 W。

(2)提取温度。提取温度分别设置为55、60、65、70、75 ℃，其他提取条件一致，即以50%乙醇为溶剂，料液比为1∶20，提取时间9 min，微波功率设置为400 W。

(3)微波功率。微波功率分别设置为300、400、500、600、700 W，其他提取条件一致，即以50%乙醇为溶剂，料液比为1∶20，提取温度70 ℃，提取时间9 min。

(4)料液比。料液比分别设置为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，其他提取条件一致，即以50%乙醇为溶剂，微波功率为400 W，提取温度为70 ℃，提取时间9 min。

(5)乙醇浓度。以乙醇为溶剂，提取浓度分别设置为40%、50%、60%、70%、80%，其他提取条件一致，即微波功率500 W，料液比为1∶30，提取温度70 ℃，提取时间9 min。

上述试验均采用NaNO-Al(NO)-NaOH比色法测定OD值，根据“..”标准曲线计算提取液中总黄酮含量。

提取工艺优化试验。根据“..”单因素试验获得的最佳参数，以乙醇浓度(A)、提取时间(B)、料液比(C)、提取温度(D)、微波功率(E)为考察因素，每个因素设置4个水平，采用L(4)正交试验设计(表1)研究最佳工艺，以提取液中总黄酮含量为评价指标。

最佳工艺条件验证试验。对“..”获得的最佳工艺进行验证，即取1.0 g构树叶粉末，采用最佳提取工艺进行总黄酮提取，重复5次，检测提取液中总黄酮含量。

最佳工艺放大试验。精确称取10.0 g构树叶粉末，采用“..”的最佳提取工艺进行总黄酮提取，重复5次，检测提取液中总黄酮含量。粗提液采用AB-8型树脂分离纯化。

表1 微波辅助法提取工艺的L16(45)正交试验设计

试验数据采用Excel 2016软件初步整理，采用SPSS 22.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

从图2可以看出，随着提取时间延长，构树叶总黄酮的提取量逐渐增加，9 min时达到峰值，之后呈现下降趋势。

图2 不同提取时间对总黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of different extraction time on the extraction content of total flavonoids

从图3可以看出，随着提取温度升高，构树叶总黄酮的提取量迅速增多，70 ℃时达到峰值，之后呈下降趋势。

图3 不同提取温度对总黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of different extraction temperature on the extraction content of total flavonoids

从图4可以看出，构树叶总黄酮提取量随微波功率增加(300～600 W)逐渐增多，600 W时到达峰值，随后随功率呈下降趋势。

图4 不同微波功率对总黄酮提取量的影响Fig.4 Effect of different microwave power on the extraction content of total flavonoids

从图5可以看出，料液比在1∶15～1∶30，随着料液比的增加总黄酮提取量呈增加趋势，1∶30时达到峰值，之后呈下降趋势。

图5 不同料液比对总黄酮提取量的影响Fig.5 Effect of different solid-liquid ratio on the extraction content of total flavonoids

从图6可以看出，随着乙醇浓度增加构树叶总黄酮提取量呈先升高后下降趋势，乙醇浓度为70%时，总黄酮提取量达到峰值。

图6 不同乙醇浓度对总黄酮提取量的影响Fig.6 Effect of different ethanol concentration on the extraction content of total flavonoids

由表3可知，各因素对构树叶总黄酮提取量的影响从大到小依次为A>B>E>C>D，最佳提取条件为ABCDE。

方差分析结果表明，试验数据具有统计学意义。综合考虑，最终确定的最佳提取工艺为乙醇浓度70%、提取时间9 min、料液比1∶35、提取温度70 ℃、微波功率700 W。

表3 正交试验结果分析

最佳工艺条件验证试验结果显示，在最佳提取工艺条件下自1 g构树叶提取的提取液中总黄酮含量为25.83 mg/g，RSD为0.71%。高于正交设计表中的最大值，表明所确定的提取工艺稳定性和可靠性较好。

最佳工艺放大试验结果显示，在最佳提取工艺条件下自10 g构树叶提取的提取液中总黄酮含量为26.12 mg/g，与放大前试验提取量基本一致，进一步验证了所建立提取工艺具有良好的稳定性、可靠性。经纯化后总黄酮含量为52.17 mg/g。

3 讨论与结论

楚冰芳等研究发现在超声频率40 kHz下，构树叶总黄酮的最佳提取工艺条件为料液比1∶30(g∶mL)、超声时间40 min、乙醇浓度50%、超声温度50 ℃。艾微等研究发现采用微波辅助法提取藿香叶总黄酮的最佳工艺为料液比1∶60(g∶mL)、乙醇浓度60%、微波功率567 W、提取时间70 s。周一鸣等研究发现微波提取苦荞皮中总黄酮的最佳工艺条件为pH 10.0、乙醇浓度50.3%、料液比1∶32.6、预浸时间19.7 min、反应温度70 ℃、反应时间20 min。高岐等研究发现采用微波辅助提取洋葱中的黄酮类化合物的最佳工艺条件为料液比1∶10、反应功率900 W、反应时间5 min、乙醇浓度为80%。焦士蓉等研究确定微波辅助提取芦柑皮中黄酮类物质的最佳工艺条件为乙醇浓度80%、微波功率280 W、料液比1∶25，每次反应时间为80 s，反复3次。易灿等研究发现山银花总黄酮的最佳微波辅助提取法工艺为料液比1∶20.5(g∶mL)、提取时间8.0 min、乙醇浓度60.5%、微波功率394 W。杨永涛研究了罗布麻总黄酮的微波辅助提取法，确定最佳工艺为乙醇浓度55%、提取温度50 ℃、提取时间25 min、料液比为1∶35(g∶mL)、超声功率400 W。由此可见，不同植物种类中黄酮类化合物的提取工艺条件不尽一致。

该试验以乙醇为溶剂，采用单因素和正交试验优化后得到的微波辅助提取法提取构树叶总黄酮的最优工艺为乙醇浓度70%、提取温度70 ℃、提取时间9 min、料液比1∶35(g∶mL)、微波功率700 W，该工艺与上述报道比较具有需时短的优势；验证试验结果显示该提取工艺稳定性较好，因此用于构树叶总黄酮的提取具有较好的实用性。