亚甲蓝对兔心脏骤停后脑缺血再灌注损伤保护作用研究

苏成洋，任亮亮，梁志娟，司江华，于 澄

兰州市第一人民医院 神经内科，甘肃 兰州 730050

心脏骤停引起大脑缺血缺氧性损伤。自主循环恢复（return of spontaneous circulation，+ROSC）过程中，血流和氧供的恢复引起大脑再灌注损伤。因此，心脏骤停后，脑损伤本质为缺血再灌注损伤。目前，心脏骤停后脑保护公认的有效治疗方法有目标温度管理与高压氧，但并未显著改善+ROSC 患者存活率和预后［1-2］。有研究报道，亚甲蓝（methylene blue，MB）在许多神经疾病中表现出治疗潜力，其神经保护作用已经在阿尔茨海默病、帕金森病、中风以及视神经病变的体内模型中得到证实［3-6］。低剂量MB具有较好的安全性，且具有抗氧化性，可迅速穿过血脑屏障，对脑部神经元细胞有一定保护作用［7-8］。目前，MB 对心脏骤停后全脑缺血再灌注损伤作用的相关研究较少。本研究旨在探讨MB 对心脏骤停后兔脑缺血再灌注损伤的保护作用，以期为临床应用提供理论依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级家兔50 只，雌雄不限，体质量（2.5±0.5）kg（由兰州大学基础医学院提供），按随机数字表法将家兔在麻醉置管前分为5 组，假手术组、空白对照组、小剂量MB 组（1.0 mg/kg）、中剂量MB 组（5.0 mg/kg）及高剂量MB 组（10.0 mg/kg），每组10 只。

1.2 药物与仪器 MB 注射液（济川药业集团有限公司，批号：1711012）；盐酸肾上腺素注射液、肝素注射液及盐酸利多卡因（兰州大学第二医院重症医学Ⅰ科提供）；25%乌拉坦（兰州大学中心实验室提供）；4%多聚甲醛溶液（雷根生物技术有限公司，批号：DF0135）；兔神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、S-100β蛋白、半胱天冬酶-3（Caspase-3）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；医用分子筛制氧机（ZH-A31W，江苏江航医疗设备有限公司）；全波长酶标仪/超微（Epoch，Biotek Instruments，美国伯腾仪器有限公司）；小动物呼吸机（HX-100E，成都泰盟科技有限公司）；BL-420E 多导联生物功能实验记录仪（BL-420E，成都泰盟科技有限公司）；心电监护除颤仪（TEC-7621C，日本光电公司）；高速台式冷冻离心机（TGL-16G，上海安亭科学仪器厂）；交流电电压转换器（上海变压器厂）。

1.3 动物模型制备及处理 术前12 h 禁食、不禁水，兔耳缘静脉注射25% 乌拉坦麻醉，剂量为4 ml/kg。仰卧固定，无菌操作下行气管插管，自由呼吸室内空气；分离右颈总动脉，缓慢插入动脉导管用以测定平均动脉压（mean artery pressure，MAP）并采取血液标本。假手术组不建立心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation，CPR）模型，仅行麻醉、气管插管和颈动脉置管。其他4 组采用体外电击诱发室颤模型，50 V 交流电持续放电50～80 s，监护仪显示出现心室颤动波形及MAP ＜20 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）并持续3 min，提示心脏骤停模型制备成功。模型制备成功后立即行CPR，胸外按压（按压频率200 次/min，按压深度为兔胸廓前后径1/3）与机械通气［吸入空气中氧气浓度（fraction of inspiration O2，FiO2）1.0，通气频率30 次/min，潮气量15 ml/kg］同时进行，并给予肾上腺素30 μg/kg，复苏2 min 时，若心电图仍为心室颤动波或正常动脉搏动波消失，给予30 J 双相波除颤，复苏2 min 为1 个循环；5 个循环后自主循环仍未恢复视为复苏失败。+ROSC 标准：心电图显示自主心律，MAP ≥60 mmHg并持续10 min。在CPR 开始即刻，空白对照组经腹腔注射生理盐水10 ml；小剂量MB 组、中剂量MB 组及高剂量MB 组分别经腹腔注射MB 注射液1.0 mg/kg、5.0 mg/kg 及10.0 mg/kg。5 组兔均于+ROSC 后24 h放血处死并迅速取出全脑组织用以测定脑组织含水量及观察海马CA1 区病理变化。

1.4 观察指标 各组兔均于致颤前15 min 及+ROSC 后1、6、12 及24 h 从右颈内动脉采血2 ml，注入6 ml 一次性负压真空无菌采血管静置15 min后，以3 000 r/min 离心20 min，取血清置于-20℃保存。采用酶联免疫吸附法检测脑损伤标志物（NSE、S-100β 蛋白）及凋亡蛋白酶Caspase-3 水平。

1.5 脑组织含水量测定 采用干湿重法测定脑组织含水量。电子天平精确称量脑组织质量并记录后，将脑组织置于100℃烤箱烘烤24 h 后再称量其质量并记录。采用按Ellis 公式计算脑组织含水量。

脑组织含水量=［（湿质量-干质量）/湿质量］×100%

1.6 脑组织病理学观察 甲醛完全浸泡兔脑后，分离出海马组织，通过脱水、包埋及切片程序备好石蜡切片，然后进行苏木精-伊红染色，电镜镜检，采集分析图像，观察海马CA1 区病理变化。

1.7 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（）表示，各组不同时间点比较采用重复测量方差分析，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组NSE、S-100β 蛋白、Caspase-3 及脑组织含水量比较 +ROSC 后24 h 脑组织含水量，假手术组为（56.86%±2.99%）、空白对照组为（72.63%±4.61%）、小剂量MB 组为（66.99%±3.95%）、中剂量MB 组为（62.71%±5.45%）、高剂量MB 组为（69.80%±5.65%）。致颤前15 min，各组NSE、S-100β 蛋白及Caspase-3比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。空白对照组、小剂量MB 组、中剂量MB 组及高剂量MB 组+ROSC后1、6、12、24 h NSE、S-100β 蛋 白、Caspase-3 以及+ROSC 后24 h 脑组织含水量均较假手术组明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05），表明造模成功。+ROSC 后24 h，小剂量MB 组、中剂量MB 组及高剂量MB 组脑组织含水量均低于空白对照组；小剂量MB 组、中剂量MB 组脑组织含水量低于高剂量MB 组，且中剂量MB 组低于小剂量MB 组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。+ROSC 后1、6、12、24 h，小剂量MB 组、中剂量MB 组及高剂量MB 组NSE 低于空白对照组；小剂量MB 组、中剂量MB 组NSE 低于高剂量MB 组，且中剂量MB 组低于小剂量MB 组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。+ROSC 后1、6、12、24 h，空白对照组、高剂量MB 组S-100β 蛋白、Caspase-3比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。+ROSC 后1、6、12、24 h，小剂量MB 组、中剂量MB 组S-100β 蛋白、Caspase-3 低于空白对照组，且中剂量MB 组低于小剂量MB 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组NSE、S-100β 蛋白、Caspase-3 比较（）

表1 各组NSE、S-100β 蛋白、Caspase-3 比较（）

注：与假手术组比较，①P＜0.05；与空白对照组比较，②P ＜0.05；与小剂量MB 组比较，③P＜0.05；与中剂量MB 组比较，④P＜0.05

2.2 各组海马CA1 区病理学观察 假手术组未见明显异常；空白对照组可见神经细胞明显水肿并伴有散在红色神经元细胞；低剂量MB组、中剂量MB组、高剂量MB 组红色神经元细胞及神经元细胞水肿程度较空白对照组减轻，其中，中剂量MB 组减轻程度较明显。见图1。

3 讨论

随着复苏技术不断完善、CPR 指南逐步更新，心脏骤停患者+ROSC 率提高至47%［9］。然而，近30 年来，院外心脏骤停出院存活率未见显著变化，不同人群中的总体存活率为6.7%～8.4%，平均存活率为7.6%［10］；院内心脏骤停患者出院存活率为12.0%～22.0%，平均存活率为17.0%［11］。由此可见，心脏骤停患者+ROSC 率提高并非意味着出院存活率及生存质量提高。心脏骤停患者+ROSC 后，机体发生一系列复杂的病理生理改变，包括心脏骤停后脑损伤、心肌功能异常、全身性缺血-再灌注损伤和尚未消除的触发心脏骤停的各种原有疾病（或病因）［12］。心脏骤停后脑损伤是22.9%院内心肺功能停止（in-of-hospital cardiac arrest，IHCA）患者和67.7% 院前心肺功能停止（out-of-hospital cardiac arrest，OHCA）患者死亡的主要原因［13］。大脑不仅对缺血敏感，对再灌注同样敏感，+ROSC 过程中，血流和氧供的恢复引起大脑再灌注损伤，心脏骤停后脑损伤本质为缺血再灌注损伤。有研究报道，脑缺血再灌注损伤可能是由心脏骤停期脑灌注不足和随后的脑水肿引起［14］。尽管已经认识到脑水肿是心脏骤停后脑损伤的重要特征和评估预后的重要指标，但心脏骤停后脑水肿相关研究较少［15］。动物模型神经病理学和神经影像学研究报道，心脏骤停导致的全脑缺血再灌注损伤更易损伤海马区［16-17］。因此，脑海马区成为研究神经元水肿、坏死及凋亡的重要区域。凋亡是一种典型的Caspase 依赖性的程序性细胞死亡，Caspase-3 激活是凋亡诱导途径的共同特征，其在脑缺血再灌注损伤后增加［18］。此外，脑缺血再灌注损伤的生物标志物是S-100β 蛋白、NSE，两者主要来源于中枢神经系统［19］。

本研究结果显示，小剂量MB 组、中剂量MB 组及高剂量MB 组+ROSC 后24 h 脑组织含水量均低于空白对照组；+ROSC 后1、6、12、24 h，小剂量MB 组、中剂量MB 组及高剂量MB 组NSE 低于空白对照组；+ROSC 后1、6、12、24 h，小剂量MB 组、中剂量MB 组S-100β 蛋白、Caspase-3 低于空白对照组。其中，中剂量MB（5.0 mg/kg）用药对脑组织含水量、NSE、S-100β 蛋白、Caspase-3 的降低更明显。本研究脑组织海马CA1 区病理观察显示，低剂量MB 组、中剂量MB 组、高剂量MB 组红色神经元细胞及神经元细胞水肿程度较空白对照组减轻，其中，中剂量MB 组减轻程度较明显。

综上所述，MB 对心脏骤停后兔脑缺血再灌注损伤有一定保护作用，应用中剂量MB（5.0 mg/kg）的保护作用较明显，其可能通过减轻脑水肿程度、改善脑组织形态、抑制凋亡等途径发挥脑保护作用，关于MB 对心脏骤停后全脑缺血再灌注损伤的作用机制还需进一步研究探讨。