不同钾源对菠萝叶片元素吸收及转运相关基因表达的影响

薛亚茹， 杨晓雪， 张亚如，李映志，叶春海

(广东海洋大学滨海农业学院，广东 湛江 524000)

【研究意义】菠萝[Ananascomosus(Linn.) Merr]属凤梨科(Bromeliaceae Juss.)凤梨属 (AnanasMill.)，是热带著名的水果。据联合国粮农组织发布的统计数据，2020年我国菠萝种植面积9.96万hm2，总产量263.93万t，位居世界第三(FAO，2022)，但是单产量较世界平均水平较低。施肥管理技术的缺失，导致肥料利用率低，施肥比例和施肥时期会严重影响菠萝的生长发育，合理的施肥管理是解决菠萝高效生产问题的重要途径之一。【前人研究进展】菠萝的研究主要集中在成花机制、产量和品质上，梁李宏等[1]研究得出合理增施氮、磷肥能提高香水菠萝单果重和产量，过量施用钾肥有降低香水菠萝产量的可能；马海洋等[2]在大田试验条件下研究氮、磷、钾肥不同配比对卡因菠萝产量和品质的影响，认为施磷肥对菠萝果实品质影响不大。尽管国内外学者开展了大量研究，但对菠萝叶片养分及磷钾吸收转运机制的研究较少。叶片是作物进行光合作用的主要器官，根据叶片营养元素的积累动态，可以反映出菠萝的养分需求和分配规律，为科学施肥及制定合理的栽培技术提供重要的理论依据[3]。陈菁等[4]对菠萝不同品种不同发育期氮、磷、钾养分累积差异性进行了研究，探求不同品种菠萝在不同发育期对氮磷钾的需求；王金辉等[5]研究了在不同施肥条件下，香水菠萝叶片氮磷钾含量的动态变化及氮磷钾肥对香水菠萝叶片养分含量的影响；前人研究表明适量增施氮、钾肥能显著提高菠萝叶片氮、钾含量，磷肥对菠萝叶片磷含量的影响则不明显[5]，施钾可以增加菠萝叶片钾元素的含量[6]，施用氮肥会增加菠萝产量，也会增加植株对N、P、K及中微量元素的吸收[7]。也有研究者利用滴灌技术探索菠萝需肥特性，在滴灌施肥下，氮、磷、钾肥的利用率显著提高，菠萝对钾的需求量最大[8]。以上研究说明适量施用氮肥、钾肥可以提高叶片氮、钾含量，且对产量有积极影响。【本研究切入点】目前对菠萝的研究大多集中于提高产量与品质，对氮肥及氮元素的研究较多，磷钾元素的吸收与利用机制方面的研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】本研究分析了不同钾源处理对菠萝叶片磷和钾元素吸收及转运相关基因表达的影响，以期为进一步开展菠萝叶片磷和钾元素吸收及转运机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 研究材料

实验地点在广东海洋大学林果楼(110°18′30″E，21°09′40″N)。试验所用材料为定植于营养钵内的“金菠萝”幼株，培养基质为通用型植物生长无土基质。实验处理前定期浇水，维持正常生长，待植株叶片达到10片叶时，进行施肥处理。

1.2 实验处理

选择长势良好、大小相似的菠萝植株，按随机区组方法设计试验。试验共设置MS营养液、10.029 mmol/L K2HPO4(T1)、20.054 mmol/L KCl(T2)、1.250 mmol/L K2HPO4(T3)、1.250 mmol/L NaH2PO4(T4)5个处理，以H2O(CK)为对照，每个处理3株，重复3次。其中T1、T2中钾含量与MS培养液一致，T3、T4中磷的含量与MS培养液一致。施肥后2 d取样1次，共施肥3次。

1.3 样品采集与处理

施肥处理后，隔2 d开始采样，共采集3次。样品采集时间均为16:00。采集的叶片用冰盒带回实验室，经自来水—蒸馏水清洗擦干，分成两份，一份-80 ℃冰箱保存，用于基因表达分析；另一份放入105 ℃烘箱杀青30 min后，转80 ℃烘干至恒重，随后充分磨碎，干燥保存，用于P、K元素含量分析。

1.4 测定方法

叶片P元素含量的测定使用钼锑抗比色法[9]，叶片K元素含量的测定使用火焰原子吸收法[9]。

使用试剂性RNA提取试剂盒(TAKARA)提取菠萝叶片总RNA，RNA反转录(Prime Script RT reagent Kit，TAKARA)后，利用基因特异引物进行荧光定量 PCR( SYBR®Premix ExTaqTMII，TAKARA)分析，每个样品重复3 次。

1.5 数据分析

采用Microsoft Excel 2010软件对试验数据进行结果统计，利用SPSS软件对统计的数据进行差异显著性分析。采用2-ΔΔCt法计算基因的表达量。

表1 引物和内参基因的序列

2 结果与分析

2.1 不同磷钾源对菠萝叶片磷、钾元素含量的影响

如图1所示，施肥处理后2、4、6 d，T3和T4处理后的菠萝叶片磷含量与对照相比均显著提高，T1与T2处理后各个时期磷含量与对照无显著差异。以上结果表明，T3、T4处理对菠萝叶片磷元素的吸收与积累有一定的促进作用，适量的钾元素会促进磷元素的吸收与积累，过量则会抑制。

如图2所示，在处理后2 d，与对照相比，T1、T2、T3、T4处理后菠萝叶片钾元素含量显著提高；处理后4 d，与对照相比，T2处理后菠萝叶片钾元素含量显著提高；处理后6 d，与对照相比，T1处理后菠萝叶片钾元素含量显著提高。以上结果说明，T1、T2、T3、T4处理只在短期内对菠萝叶片钾元素含量的吸收与积累有一定的促进作用。

2.2 NaH2PO4处理对菠萝叶片磷转运相关基因表达的影响

如图3所示，T4处理后不同时间，AcPHT2、AcPHT3、AcPHT4、AcPHT6基因的表达水平出现显著差异。从各基因的变化模式上看，AcPHT6基因的表达水平显著升高，AcPHT2、AcPHT3、AcPHT4基因的表达水平均显著下降，AcPHT1、AcPHT5基因的表达水平无显著变化。AcPHT2、AcPHT3、AcPHT4基因在施肥处理后基因表达水平显著降低，可能因为这些基因与缺磷响应有关；AcPHT6基因的表达水平在施肥处理后显著升高，推测该基因可能参与磷的转运分配。

2.3 KCl处理对菠萝叶片钾转运相关基因表达的影响

如图4所示，在T2处理后的不同时间，AcNa/

H1、AcKUP1、AcNHX、AcHKT、AcKUP2基因的表达水平均出现显著差异。从各基因的变化模式上看，除AcNa/H2基因的表达水平无显著差异外，其余基因表达水平均显著降低，其中AcKUP1、AcNHX基因表达水平逐渐下降，AcNa/H1、AcHKT、AcKUP2基因表达水平表现出先升高后又下降的变化趋势。处理后4 d，AcNa/H1、AcHKT、AcKUP2基因表达水平的差异达到最大。AcKUP1、AcNHX基因在施肥处理后基因表达水平显著下降，该基因可能与缺钾响应有关。

2.4 K2HPO4处理对菠萝叶片磷钾转运相关基因表达的影响

K2HPO4含有磷和钾两种营养元素。T1和T3的浓度不同，其P含量和K含量也不同；T3与T4处理对磷转运相关基因表达水平的影响存在差异。如图5所示，T3处理后，除AcPHT6基因的表达水平表现出先下降后升高的变化趋势外，其余磷转运蛋白相关基因的表达水平均呈现先升高后下降的变化趋势，其中AcPHT1、AcPHT2、AcPHT3、AcPHT4基因的表达水平在处理后4 d达到最高，显著高于其他两个处理时间；AcPHT6基因的表达水平在处理后6 d基因表达水平显著升高。

T1与T2处理后对钾转运相关基因表达水平的影响也有差异。T1处理后(图6)，AcKUP1基因表达水平呈先升高后下降变化趋势，AcNa/H1和AcNa/H2基因的表达水平表现出先下降后升高的变化趋势，AcNHX、AcHKT、AcKUP2基因的表达水平逐渐升高。处理后6 d，AcNa/H2、AcNHX、AcHKT、AcKUP2基因的表达水平显著升高。AcNHX、AcHKT、AcKUP2基因的表达水平在施肥处理后显著升高，这些基因可能参与了植物体内钾元素的转运与利用。

3 讨 论

磷是植物生长发育过程中所必需的大量元素，是AMP、ADP和ATP中的重要组成成分，光合作用过程中许多辅酶如NAD+、NADP+中也含有磷元素；钾是重要肥力因子，参与调控植物的很多生理代谢过程，且可提高光合作用强度，促进植物体内淀粉和糖形成，改善植物产品品质，增强植物抗逆性[10]。植物在生长发育过程中需要不断从外界吸收养分，以满足自身生命活动的需求，在植物生长发育的各个阶段，对养分的种类、需求量都是不同的。近年来，国内外针对‘卡因’和‘台农4号’等菠萝品种建立了氮、磷、钾施肥量与产量三元二次模型，这些施肥模型的研究对菠萝的合理施肥具有重要的指导意义，但菠萝对养分的吸收同时也受到品种、土壤理化性质和管理模式等的综合影响[11]，其内部机制也会存在差异。

陈菁等[12]研究发现，叶面喷施10%、15%过磷酸钙浸出液3次增加了菠萝前期叶片磷含量；苏苑君等[13]研究表明，在0.6 mmol/L NaH2PO4水平下，生菜全生育期总矿质元素吸收量最大。黄美华等[14]研究表明，不同磷肥施用量对块茎氮、磷积累无显著影响，但钾积累随着施磷量的增加呈先增加后减少的趋势。周厚基等[15]研究表明增施磷、钾肥对促进果树新梢枝条生长具有重要作用。本研究结果表明，在菠萝中，含有磷元素与钾元素的处理较只含单一磷元素或钾元素的处理更能促进叶片对磷元素和钾元素的积累。

基因表达受环境条件和植物自身遗传特性的影响，可以反映作物的真实生长和代谢状态。磷转运蛋白 (Phosphate transporter)能够控制植物对磷的吸收和转运，对提高植物磷利用率具有重要作用。Liu等[16]通过番茄的分根实验发现，只有当植株的全部根系处于低磷胁迫时才有LePt1,LePt2的表达，并且分根植株的基因的总表达量介于所有根系完全供给充足磷和所有根系处于磷饥饿的植株之间。这些发现表明调控磷转运蛋白基因的信号来自于植物的茎，并且该信号可能于茎中磷浓度有关，可能受植物体内部信号机制的调控。AcPHT6基因在植物体内磷元素含量降低的情况下基因表达水平上升，可能为高亲和力磷转运蛋白。在磷匮乏条件下，部分拟南芥的PHT1基因可显著上调表达，它们可能通过PHR1介导的途径参与磷响应调控[17]。水稻整个发育过程都受到OsPHT2;1基因表达的调控，该基因的表达还在一定程度上影响了PHT1基因的表达[18]，说明这些基因并不是单独起作用。从T3和T4处理的对比看，处理后4 d，AcPHT1、AcPHT2、AcPHT3、AcPHT4、AcPHT5基因的表达在T3处理下表现出更高水平，外界钾离子可能影响植物对磷元素的吸收，进而影响植物磷转运相关蛋白基因的表达水平。韩利红等[19]鉴定分析了菠萝PHT1家族基因，发现该家族基因启动子区含有大量与植物生长发育、响应激素和胁迫信号相关的顺式作用元件，推测该家族基因受多种信号调控，在植物生长发育、应对环境胁迫过程中发挥作用，但它在菠萝体内的生物学功能还未进行验证。本研究结果表明，除AcPHT6基因外，其余磷转运蛋白相关基因的表达水平均在T3处理下高于T4处理，推测外源钾元素可能会影响植物对磷元素的吸收，进而影响相关磷转运蛋白的基因表达水平，这与施肥处理后菠萝叶片磷元素含量的结果一致。

目前，已在多种植物中开展了磷、钾吸收和调控机制的研究，但只在少数模式植物中取得了突破性的进展。植物中磷、钾相关转运蛋白对应养分的吸收、分配、转运往往并非受单一因素控制，而是受多种因素共同作用，且在不同植物中表达模式也有差异。本文对菠萝中的磷、钾转运相关蛋白基因在不同磷、钾源影响下的表达模式进行了研究，为菠萝植株磷、钾元素的吸收及转运机制研究奠定了基础，但相关机制仍需进一步借助组学、生物信息学和基因工程等相关技术进行更深入的探究。

4 结 论

T1、T2、T3、T4处理只在短期内对菠萝叶片钾元素含量的吸收与积累有一定的促进作用；除AcNa/H1基因外，T1处理后，其余钾转运相关基因的表达水平都高于T2处理，部分钾转运相关蛋白的基因表达水平可能受磷供应的调控；AcKUP1、AcNHX基因在T2处理后基因表达水平显著下降，这些基因可能与缺钾响应有关；T3、T4处理对菠萝叶片磷元素的吸收与积累有一定的促进作用。AcPHT2、AcPHT3、AcPHT4基因在T4处理后基因表达水平显著降低，可能因为这些基因与缺磷响应有关；AcPHT6基因的表达水平在T4处理后显著升高，推测该基因可能参与磷的转运分配。