西兰花水浸提液对野稷种子萌发和幼苗生长的影响

王 煜， 赵远征， 王 东， 东保柱， 周洪友

(1.内蒙古农业大学园艺与植物保护学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.内蒙古自治区农牧业科学院植物保护研究所，内蒙古呼和浩特 010031)

燕麦(L.) 是禾本科(Gramineae)燕麦属()1年生草本植物，是第七大禾谷类作物，也是重要的粮、饲兼用型作物。目前我国对燕麦的研究多集中在育种与栽培技术方面，针对燕麦田杂草防除的研究还很少见。燕麦作为阴山北麓地区主栽作物之一，其产量低且不稳，杂草危害严重是造成燕麦产量低下的根本原因之一，严重制约了燕麦产业的发展。在内蒙古燕麦种植区，燕麦田间的常见杂草如藜 (Linn.)、沙蓬(Moq.)、猪毛菜(Pall.) 等阔叶类杂草的防除可以使用化学手段。而燕麦田中禾本科杂草，如野稷难以用化学药剂进行防除，缺乏有选择性的除草剂。近年来，野稷[(Kitag.) Chang comb. Nov.]因其抗旱、耐贫瘠的特点逐渐演变为燕麦田主要杂草，危害日益严重，针对野稷的防除日趋重要。

随着植物化感作用研究日渐深入，生物防治杂草已经成为了农业生产中一项重要的防除杂草措施。目前农业对于化感作用应用比较普遍的方式主要集中在轮作、残渣覆盖、伴生植物防治等宏观措施。轮作后秸秆还田作为一种常规的农田管理措施可以有效地防控杂草，通过竞争水分、光照来影响杂草生命周期的同时，利用向田间释放出的化感物质来抑制杂草。自然环境下，化感物质存在于植物中，由水溶性物质和不溶于水的物质组成。利用水浸提法来研究植物的化感作用，即用水作为溶剂来溶解浸提植物目标部位以获得植株体内化感物质，是最直接有效的方法。

十字花科植物因其特有的化感物质“芥子油苷”，被称为化感作物。关于芥子油苷化感作用的研究主要集中在影响其他植物种子萌发、生长方面。有研究表明，在种过甘蓝的土壤上，豆科植物苜蓿产量降低，并且在土壤中放置甘蓝根块，苜蓿种子萌发也会受到明显的抑制。国外有研究利用十字花科芸苔属植物残体覆盖于土壤表面或与土混合，抑制杂草种子萌发，从而达到控制杂草的目的。本研究以野稷种子为受体，西兰花为供体，研究西兰花化感物质对燕麦田常见杂草野稷种子的萌发及生长的影响，通过检测活性氧含量以及抗氧化防御酶的活性，分析西兰花产生的化感物质对野稷生理的具体影响，为西兰花化感除草提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供筛选的西兰花品种绿娃娃、中华绿秀、中青12，种植于内蒙古农业大学农场。供试受体植物野稷种子由野外采集获得，经种子萌发测试，供试种子发芽率均在95%以上。

1.2 研究方法

1.2.1 室内筛选对野稷具有化感抑制作用的西兰花品种 试验于2019年12月在内蒙古农业大学园艺与植物保护学院日光温室内进行。西兰花残体收集与处理：西兰花收获后将其剩余的植物组织部分(包括地上部和根部)带回实验室，用多功能粉碎机(永康市红太阳机电有限公司)打碎残体，称取打碎后的不同品种西兰花残体14 g加入培养基质中混匀，喷洒少量的水保持土壤含水量为30%。挑选均匀一致的野稷种子，每个花盆100粒，以不含西兰花残体的培养基质为空白对照，每个处理4次重复。将盆栽置于日光温室内进行培养，培养期间适时补充水分保持湿度。温室培养21 d后，调查西兰花残体对野稷生长相关性状(出苗数、干质量、鲜质量)的影响。

萌发率计算公式：

萌发率=已萌发的种子/供试种子数×100%。

1.2.2 西兰花水浸提液的制备 采收西兰花的花球后，单独收集西兰花品种绿娃娃残体的新鲜叶片，后将叶片用刀剁碎至约为0.5 cm×0.5 cm的碎片备用。使用电子天平准确称取西兰花碎叶加入三角瓶，并向瓶中注入100 mL蒸馏水，将其配置成为0.01、0.03、0.05、0.07、0.14、0.28 g/mL等不同质量浓度的西兰花叶片水溶液，于25 ℃的恒温条件下浸提24 h，间隔12 h搅拌1次，然后用纱布过滤掉西兰花碎叶残渣，回收的液体即为西兰花水浸提液。

1.2.3 西兰花水浸提液对野稷种子发芽的影响试验 在超净工作台中向组培瓶中加入50 mL灭菌后含4%琼脂的MS培养基，在培养基将要凝固时，使用0.22 μm的滤膜对浸提液进行过滤灭菌，之后向培养基中加入5 mL西兰花水浸提液。采用Li等的方法对野稷种子进行表面消毒，将种子在0.5% KMnO中浸泡20 min，使用无菌水冲洗3遍，将KMnO冲洗干净。共设置6个质量浓度(0.01、0.03、0.05、0.07、0.14、0.28 g/mL)的西兰花水浸提液处理野稷种子，空白对照中加入5 mL蒸馏水，组培瓶内放置50粒野稷种子，每个处理设置10瓶，共70瓶。将组培瓶放在光照培养箱中，培养条件(温度25 ℃，16 h光照，8 h暗期)。分别记录1～5 d的种子萌发数(以种子露白为萌发标准)，计算萌发率。

1.2.4 野稷幼苗生长指标的测量 野稷幼苗生长至第5天，对不同处理的野稷幼苗进行取样，分别取长势一致的幼苗进行芽长、根长、胚轴长和鲜质量的测量，记录数据并求其平均值。测量时，以种子残体为起点，将尺子顺着种子残体到生长点(顶部)测量，即为幼苗的芽长；以种子残体为起点，一直到主根最底端，即为幼苗主根的根长；以种子残体到子叶着生处的距离为胚轴长；在不同处理中各取5株幼苗称量其总鲜质量；各项指标测量均重复3次。将测量结果统计后计算化感指数。

化感指数()计算公式：=1-(≥)；=-1(<)。式中：为处理组；为对照组。>0，表示化感促进作用；<0，表示化感抑制作用。

1.2.5 作物幼苗ROS及防御酶的测定

1.2.5.1 过氧化氢含量的测定 采用苏州格锐思生物科技有限公司的过氧化氢 (HO) 含量测试盒进行测定。

称取0.1 g组织，加入1 mL预冷丙酮，进行冰浴匀浆，转移至EP管中，用丙酮定容到1 mL，12 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清，置于冰上待测。按操作步骤加入试剂，在415 nm处，蒸馏水调零，用1 mL比色皿(光径1 cm)测定吸光度。HO含量计算方法：在25 ℃，每克组织每分钟催化分解 1 μmol HO定义为一个酶活单位U。HO含量(μmol/g)=2.1×(Δ-0.007 8)÷鲜质量。

称取0.1 g组织，加入1 mL提取液，冰浴匀浆，然后4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液作为粗提液，置于冰上待测。按照操作步骤加入试剂，蒸馏水调零，在540 nm处，用1 mL比色皿(光径 1 cm)测定吸光度。超氧阴离子含量(nmol/g)=617.3×(Δ-0.008 8)÷鲜质量。

1.2.5.3 丙二醛含量的测定 采用苏州格锐思生物科技有限公司的丙二醛(MDA)含量测试盒进行测定。

称取0.1 g组织，加入1 mL提取液，冰浴匀浆，然后4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液作为粗提液，置于冰上待测。按照操作步骤加入试剂。混匀后，在90～95 ℃水浴锅中保温30 min，取出放冰上冷却，25 ℃、12 000 r/min离心10 min，转移全部上清液于1 mL玻璃比色皿中，蒸馏水调零，分别于532和600 nm处读取吸光度，Δ=-。MDA含量(nmol/g)=16.1×Δ÷鲜质量。

1.2.5.4 过氧化氢酶活性的测定 采用苏州格锐思生物科技有限公司的过氧化氢酶(CAT)试剂盒进行测定。

称取0.1 g组织，加入1 mL提取液，冰浴匀浆，然后4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液作为粗提液，置于冰上待测。按照说明书操作步骤加入试剂。蒸馏水调零，取1 mL转移到1 mL玻璃比色皿中，510 nm处测定吸光度。CAT活性计算方法：在25 ℃，每克组织每分钟催化分解 1 μmol HO定义为一个酶活单位U。CAT[μmol/(min·g) ]=95.6×(Δ+0.002 5)÷鲜质量。

1.2.5.5 过氧化物酶活性的测定 采用苏州格锐思生物科技有限公司的过氧化物酶(POD)试剂盒进行测定。

称取0.1 g组织，加入1 mL提取液，冰浴匀浆，然后4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液作为粗提液，置于冰上待测。波长470 nm，蒸馏水调零。在1 mL比色皿中依次加入试剂，在470 nm处读取吸光度，1 min后读取，Δ=-。POD活性的计算方法：每克组织每分钟在反应体系中使470 nm处吸光度增加0.5为一个酶活力单位U。POD[Δ/(min·g)]=50×Δ÷鲜质量。

1.2.5.6 多酚氧化酶活性的测定 采用苏州格锐思生物科技有限公司的多酚氧化酶(PPO)试剂盒进行测定。

称取0.1 g组织，加入1 mL提取液，冰浴匀浆，然后4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液作为粗提液，置于冰上待测。波长420 nm，蒸馏水调零，在1 mL比色皿中依次加入试剂混匀，在420 nm处读取吸光度，1 min后读取，Δ=-。PPO活性的计算方法：每分钟每克组织在反应体系中使420 nm处吸光度变化0.005为一个酶活单位U。PPO[Δ/(min·g)]=266.7×Δ÷鲜质量。

1.3 数据处理

应用SPSS 25.0软件对数据进行方差分析及差异显著性检验(Duncan’s法，=0.05)，采用GraphPad Prism 8.0.2作图。

2 结果与分析

2.1 不同品种西兰花残体处理对野稷萌发和幼苗生长的影响

由图1、表1可知，在基质中添加不同品种的西兰花残体后，对野稷种子萌发和幼苗生长产生了不同的影响。在萌发率方面，添加绿娃娃的残体对野稷的萌发抑制作用大于其他品种。不同品种西兰花残体的加入，使野稷幼苗表现出不同的生长性状。绿娃娃残体的加入，使野稷幼苗的干质量和鲜质量均明显下降，且与其他处理有显著差异。综合野稷萌发和生长指标评价不同品种西兰花的化感抑制作用，筛选得出西兰花品种绿娃娃对野稷有较强的化感抑制作用，故使用绿娃娃作为后续试验的供体植物材料。

表1 添加西兰花残体对野稷萌发和幼苗生长的影响

2.2 西兰花水浸提液对野稷种子萌发的影响

由表2可以看出，不同浓度的西兰花水浸提液均对野稷种子的萌发有抑制作用，能够延迟其正常萌发，且随着浓度的增加，抑制作用增强。0.28 g/mL的西兰花水浸提液对野稷种子萌发的抑制作用最强，野稷种子在第5天的萌发率仅为15.00%，低浓度的西兰花水浸提液在第3天的萌发率超过了对照。可见在西兰花水浸提液处理下的野稷种子出现发芽延迟、出苗不齐的现象，在试验过程中发现对照组的野稷种子均是根先萌发，而处理组中存在大量的茎先突破种皮的现象。

表2 西兰花水提液对野稷种子萌发的影响

2.3 西兰花水浸提液对野稷幼苗生长的影响

如图2-A和图2-B所示，在加入西兰花水浸提液之后，野稷幼苗的芽和根受到了明显的抑制，并且随着浓度的升高，抑制作用增强。当浓度达到0.28 g/mL时，对根的抑制作用最强。由图1-C可知，经过西兰花水浸提液处理之后，野稷的胚轴表现出先促进后抑制的现象。由图2-D可知，在低浓度处理过后野稷幼苗的鲜质量与对照组相比，并没有显著差异；随着浓度上升，野稷的鲜质量降低。综上，西兰花水浸提液对野稷的芽长、根长、鲜质量具有不同程度的抑制作用，且都是随着浸提液浓度的升高，抑制作用增强。

2.4 西兰花水浸提液对野稷幼苗ROS和MDA含量的影响

如图3所示，不同质量浓度的西兰花水浸提液处理下的野稷幼苗过氧化氢含量均高于对照，在西兰花水浸提液质量浓度为0.07 mg/mL时，野稷过氧化氢的含量为16.40 μmol/g，对照组野稷过氧化氢的含量为7.87 μmol/g。当西兰花水浸提液质量浓度为0.14 g/mL时，超氧阴离子的含量为 1 207.03 nmol/g，显著高于对照含量(418.94 nmol/g)，具有统计学差异。不同质量浓度的西兰花水浸提液处理后均与对照有显著差异。在加入不同质量浓度的西兰花水浸提液之后，野稷丙二醛的含量均有提高，在西兰花浸提液质量浓度为0.07、0.14 g/mL时，丙二醛的含量分别为1.90、1.84 nmol/g，且与对照(1.49 nmol/g)差异显著。

2.5 西兰花水浸提液对野稷幼苗抗氧化防御酶的影响

由图4可知，在西兰花水浸提液质量浓度为0.07 g/mL时，野稷CAT活性为 15.15 μmol/(min·g)，高浓度与低浓度处理下，CAT的活性与对照均有显著差异。在加入西兰花水浸提液之后，野稷POD活性与对照相比活性降低，但差异不显著。当西兰花水浸提液质量浓度为0.14 g/mL时，PPO活性为1 505.97Δ/(min·g)，活性显著降低。

3 讨论与结论

本研究首先筛选出具有化感除草潜力的西兰花品种绿娃娃，后利用绿娃娃的叶片水浸提液进行试验，以野稷种子萌发和幼苗生长衡量西兰花的化感作用。结果显示，不同质量浓度的西兰花水浸提液均延迟了野稷种子的萌发。在第3天，低质量浓度浸提液处理后的野稷种子萌发率高于对照；在高质量浓度的浸提液处理下则能显著抑制野稷种子的萌发。牛欢欢等研究发现，光叶紫花苕子地上部浸提液明显抑制紫花苜蓿和白三叶的种子萌发， 且白三叶种子发芽率随着浓度的增加而降低。白倩等研究发现，紫花苜蓿甲醇提取液对马唐种子的萌发表现为低浓度促进高浓度抑制的作用。同时有研究发现，油菜浸提液对向日葵种子有抑制作用，且随浓度增大，抑制作用增强，而且西兰花与油菜同属十字花科作物，以上研究与我们的研究结果均表明植物的化感物质在一定程度上影响了种子的萌发。本研究目的在于使用西兰花残体的化感效应对燕麦田的杂草进行防控，同样对于燕麦的安全性评价也必须考虑在内。轮作后残体还田，植物残体的化感抑制作用只是暂时的，后期被微生物作为碳源分解后成为土壤肥料，故使用西兰花还田后种植燕麦也是将西兰花塑造为一种控制麦田杂草且充当绿肥的策略，但其对燕麦的影响还有待探究。

化感作用同样表现在对幼苗生长的影响上，本研究表明，西兰花水浸提液对野稷幼苗的根长、芽长以及鲜质量都有显著抑制作用。李雯雯等研究发现，二球悬铃木不同器官浸提液对6种受体植物幼苗胚根的生长均具有显著抑制活性。董淑琦等研究发现，谷子不同部位浸提液对狗尾草、反枝苋、藜3种恶性杂草的根长、芽长的抑制均与对照达到显著差异水平，与本研究得出的结论相一致。在本试验中，由于野稷的根直接与西兰花水浸提液接触，所以根受到的抑制程度较大。植物根系是第1个接触化感物质的器官，是植物从环境中吸收营养元素的主要器官。根系生长缺陷可能是植物响应化感物质胁迫所产生的主要毒性反应。