解磷细菌强化煤矸石肥力及影响因素研究*

谭诗咏 邓 敏 程 蓉 舒荣波 魏紫静 杨 刚

(1.四川农业大学环境学院,四川 成都 611130；2.中国地质科学院矿产综合利用研究所,四川 成都 610041；3.四川农业大学生态环境研究所,四川 成都 611130)

煤炭开采及加工过程会产生大量煤矸石,一般占煤炭总产量10%～15%[1],目前我国有煤矸石山1 500多座,侵占土地约1.5×104km2,已成为我国产出量最大的工业固体废物之一[2]。大量煤矸石无序堆放,污染水土,破坏生态环境。煤矸石具有硫分含量高、养分含量低、持水保肥性能差等特点[3],这对于矸石堆场生态恢复工作造成极大困难。因此,本研究拟借助微生物提升煤矸石养分含量,形成植物适宜的生长环境,后期再补以耐受性植物形成完整的煤矸石生态复绿技术体系,这对于煤矸石生态恢复治理具有重要现实意义。

添加外源微生物是提升煤矸石肥力的方法之一,该法是利用微生物自身代谢以及微生物与煤矸石之间相互作用来改善煤矸石养分含量[4],具有高效、经济、清洁并能减轻污染物对人类健康危害[5-6]等优点。解磷细菌是一类能分泌胞外磷酸酶和有机酸的细菌总称,能使煤矸石中难溶性无机磷和钾释放[7],从而促进植物对其的吸收利用。研究表明,利用解磷细菌处理煤矸石可明显提高其养分含量。钟艳等[8]用巨大芽孢杆菌处理低硫煤矸石后样品中碱解氮、有效磷和速效钾较初始样品分别提高1.27、33.96、6.83倍。李夏夏[9]发现,从风化土壤中筛选出的类香味细菌对煤矸石具有较好的解磷效果。贾倩倩等[10]利用硅酸盐细菌处理煤矸石后样品中有效磷和速效钾比原料分别提高了3.95、2.75倍,同时发现细菌分解能力随原料粒度的减小而增加。冯广达[11]23-24研究发现,粉煤灰中添加解磷细菌能显著提高淋滤液中的元素碳和磷含量。孔涛等[12]研究发现,接种胶质芽孢杆菌能显著提高土壤速效钾含量,与根瘤菌双接种能有效提高矿区排土场土壤复垦效果。

目前,国内外的研究主要集中在微生物对煤矸石的表观作用效果,而对于微生物与煤矸石的相互作用机制研究仍较少。因此,本研究拟以废弃煤矸石为研究对象,以解磷细菌巨大芽孢杆菌Bacillusmegateriumstrain B1(简写为B1)和地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformisstrain B2(简写为B2)为供试菌株,通过单因素培养实验、吸附实验以及扫描电子显微镜(SEM)、Zeta电位、傅立叶红外光谱(FT-IR)表征,研究解磷细菌对煤矸石基础肥力的强化效果及其作用机制,以期为煤矸石堆场生态恢复提供基础理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试煤矸石

煤矸石原料取自四川省攀西地区某矸石堆场,其基本理化性质：pH为9.36；有机质为122.80 g/kg,全氮、碱解氮、有效磷、速效钾、全磷分别为150.00、55.40、7.22、287.00、448.50 mg/kg；其主要化学成分SiO2、Al2O3、K2O、Fe、MgO、TiO2、Na2O、CaO、S、P2O5、F、Cl分别为510.3、180.6、29.5、29.4、17.3、8.2、3.7、3.3、1.86、0.87、0.67、0.45 g/kg。

1.1.2 供试菌株

B1、B2菌株均从某矿山周边污染土壤中筛选鉴定获得,SEM如图1、图2所示。

1.2 实验设计

1.2.1 菌株的富集活化及菌液的制备

菌株的富集活化：将用甘油冷冻保存的B1、B2菌悬液于37 ℃水浴锅中快速融化,平板中划线涂布培养；挑取单菌落于液体培养基中,160 r/min、30 ℃下振荡培养1～2 d,再按照1%(体积分数)接种量接种于液体培养基中,同等条件培养1～2 d,得到成熟菌体培养液。

菌液的制备：将培养好的B1、B2菌株用无菌生理盐水冲洗至灭菌三角瓶中,将菌悬液稀释至5×108～10×108cfu/g,混匀待用。

1.2.2 单因素培养实验

根据预实验,接种B1+B2混合菌对煤矸石肥力强化效果较差,因此本实验仅探讨B1、B2单菌对煤矸石肥力的强化效果。

微生物接种设计，共设置3个接种处理：对照处理,不添加任何微生物,仅加灭菌培养液；B1处理,单接种B1菌株；B2处理,单接种B2菌株。

不同因素的实验过程设计如下：

(1) 接菌量：将采集的煤矸石晾干、剔除杂质后,磨细过100目尼龙筛,121 ℃高温灭菌20 min,称取50.0 g于300 mL锥形瓶中,分别加入25.0、50.0、100.0、150.0 mL B1或B2菌悬液,在体系初始pH=7.00、30 ℃下恒温培养4 d,以仅加等量灭菌培养液为对照。

(2) 培养时间：称取30.0 g过筛灭菌煤矸石于300 mL锥形瓶中,分别加入B1、B2菌悬液及灭菌培养液100.0 mL,在体系初始pH=7.00、30 ℃下恒温培养2、4、6、8、10 d。

(3) 培养温度：称取50.0 g过筛灭菌煤矸石于300 mL锥形瓶中,分别加入B1、B2菌悬液及灭菌培养液150.0 mL,体系初始pH=7.00,于20、30、40 ℃下恒温培养4 d。

(4) 体系初始pH：称取50.0 g过筛灭菌煤矸石于300 mL锥形瓶中,分别加入B1、B2菌悬液及灭菌培养液150.0 mL,控制体系初始pH分别为6.00、7.00、8.00,30 ℃下恒温培养6 d。

实验结束后,参考文献[13]测定煤矸石pH、有机质、碱解氮、有效磷、速效钾含量,每个处理设置3个重复。

1.2.3 细菌生长曲线的测定

将B1、B2菌悬液以1%的接种量分别接种到100 mL基础扩大培养基中,于30 ℃、160 r/min下振荡培养60 h,每隔30 min取下三角瓶,将菌液倒入比色皿中,在可见分光光度计(EV-2600A)上读取600 nm处吸光度(OD600),记录并绘制生长曲线。测定步骤参考文献[14]。

1.2.4 煤矸石对不同细菌的吸附量测定

100 mL容量瓶中加入50 mL无机盐液体培养基和0.5 g煤矸石粉末,灭菌后分别接种B1、B2菌悬液2.5 mL,置于30 ℃、160 r/min摇床中培养,分别隔5、15、40、60、120、180、240、300、420、600、780、960 min进行取样,3 000 r/min离心后弃上清液,重复离心3次。无菌生理盐水多次清洗下层固体。利用可见分光光度计测定OD600,根据OD600随时间的变化绘制煤矸石的吸附曲线。

1.2.5 B1、B2菌体及煤矸石表面形貌观察

B1、B2菌体表面形貌及吸附前后煤矸石表面形貌采用SEM(FEI Inspect F50)观察,方法参考文献[15]。

1.2.6 B1、B2菌体及煤矸石Zeta电位测定

采用PALS/90PLUS型Zeta电位仪对B1、B2菌株及煤矸石初始样品测定Zeta电位。每个样品自动测定3次,计算平均值。

1.2.7 B1、B2菌体及煤矸石FT-IR分析

利用WQF/520 FT-IR仪对B1、B2菌株及煤矸石初始样品的表面官能团进行分析。使用KBr压片制样,扫描波长为500～4 000 cm-1,步调为1.0 cm-1。

1.2.8 数据处理及统计分析

采用Excel 2018及SPSS 26.0 软件对数据进行统计分析,采用Origin 2018作图。

2 结果与分析

2.1 不同影响因素对煤矸石pH和养分含量的影响

2.1.1 接菌量的影响

接菌量对煤矸石养分的影响见表1。实验组(B1和B2)样品pH与对照相比总体有所降低,并随接菌量的增加呈现出逐渐降低的趋势,其中接菌量为150.0 mL、B1处理样品pH显著降低,与对照相比降低了0.61。3种处理下样品pH总体表现为B1B2>对照。

表1 接菌量对煤矸石pH和养分的影响1)Table 1 Effect of inoculation amount on pH and nutrient of coal gangue

2.1.2 培养时间的影响

培养时间对煤矸石pH和养分的影响见表2。实验组样品pH与对照相比均有所降低,并随培养时间的延长呈现出先降后升的趋势,其中培养6 d、B1处理样品pH显著降低,较对照降低了1.04。3种处理下样品pH总体表现为B1B2>对照。

2.1.3 培养温度的影响

培养温度对煤矸石pH和养分的影响见表3。实验组样品pH与对照相比总体有所降低,其中B1处理下样品pH随培养温度的升高呈现出先降后升的趋势,并在30 ℃达到最低,与对照相比降低了0.41。3种处理下样品pH均表现为B1B2>对照。

表2 培养时间对煤矸石pH和养分的影响Table 2 Effect of incubation time on pH and nutrient of coal gangue

表3 培养温度对煤矸石pH和养分含量的影响Table 3 Effect of culture temperature on pH and nutrient content of coal gangue

表4 体系初始pH对煤矸石pH和养分的影响Table 4 Effect of system initial pH on pH and nutrient of coal gangue

2.1.4 体系初始pH的影响

体系初始pH对煤矸石pH和养分的影响见表4。实验组样品pH与对照相比总体有所降低,其中B1处理下样品pH随培养温度的升高呈现出先降后升的趋势,并在体系初始pH=7.00下达到最低,与对照相比降低了0.41。3种处理下样品pH总体表现为B1B2>对照。

2.2 不同细菌处理煤矸石的机理探究

2.2.1 细菌在液体培养基中的生长特性

不同细菌在液体培养基中的生长曲线如图3所示。B1菌株在液体培养基中0～10 h生长迟缓；10 h后进入对数生长期,活菌数呈现对数上升,生长快速；20～30 h生长平稳,此期间细菌数量处于动态平衡；35 h后进入衰亡期,死菌数量超过活菌,活菌数量呈下降趋势。B2菌株0～8 h处于迟缓期,8 h后进入对数生长期,20～40 h处于稳定期,40 h后进入衰亡期。可见,B1、B2菌株的生长速度较快,可用于改善煤矸石养分含量。

2.2.2 煤矸石对细菌的吸附量

随吸附时间的延长,两株细菌的OD600均先升后降,但趋势略有不同(见图4)。在5～420 min,B1菌株OD600由0.016升至0.247,B2菌株OD600由0.008升至0.236,说明煤矸石吸附的细菌量在不断增加；当吸附时间超过420 min后,两株细菌的OD600均下降,表示此时煤矸石中的细菌量开始减少。此外,除在240～300 min时段B2菌株的吸附量高于B1外,煤矸石对B1菌株的吸附量整体高于B2,且最佳吸附时间约为420 min。

为进一步验证细菌与煤矸石表面吸附的微形貌,采集吸附前后的煤矸石样品进行SEM生物样品制备,结果见图5。与对照相比,B1和B2菌株吸附于煤矸石表面。

2.2.3 细菌的Zeta电位

在体系初始pH=7.00的条件下,B1、B2菌株及煤矸石样品的Zeta电位分别为-10.26、-11.93、-25.80 mV。通过计算B1、B2菌株与煤矸石样品的电位差可知,相较于B2菌株,B1菌株携带相对较少的负电荷,与煤矸石的电位差更大,即更易吸附于样品表面,这可能是由于B1菌株表面具有更高的胞外聚合物和蛋白质含量,从而使其具有更高的等电位点[16],从而具有较高的Zeta电位。

2.2.4 FT-IR分析

为进一步探究两株解磷细菌对煤矸石肥力强化效果差异,对B1、B2菌株及煤矸石样品分别进行FT-IR分析,在细胞水平上获取相关结构信息,结果见图6。B1、B2菌株蛋白质的酰胺Ⅰ带和Ⅲ带中均存在大量的C=O、N-H等官能团,能通过静电作用和配位作用等方式与金属离子结合,而煤矸石中铝离子和铁离子是容易发生配位作用和静电吸附的金属离子。B1、B2菌株容易通过静电吸附和配位作用与煤矸石中金属离子产生吸附。其中,2 965 cm-1处B2菌株代表官能团C-H键产生伸缩振动。由于C-H键的强度较大,且C和H的电负性相差很小,导致C-H极性很小,属于弱电极性[17]。因此,B2菌株的稳定性强于B1,即B1菌株的吸附能力强于B2,能更好地吸附在煤矸石表面。这与2.2.2、2.2.3节结果相符合。

3 讨 论

3.1 影响因素对煤矸石pH和养分含量的影响

本研究表明,接种微生物能有效改善煤矸石基本理化性质,尤其显著提高煤矸石有效磷含量、降低其pH,这与赵陟峰[18]利用外源微生物改良煤矸石的研究结果相符合。根据解磷细菌的溶磷机理,pH和有效磷含量的变化是衡量细菌解磷能力强弱的重要指标[19]。pH是菌种生长的化学因子,对微生物生长有较大影响。适宜的pH有利于提高溶磷效率[20],pH过高或过低会对基质肥力和植物生长产生负面影响。解磷细菌代谢产生的有机酸能通过与矿物表面的阳离子形成复合物来提高磷的有效性。有机质是煤矸石基质中各种营养元素特别是氮、磷的重要来源,是衡量煤矸石肥力高低的重要指标[21]。在较短实验周期内,实验组煤矸石有机质含量均有不同程度增加,可能是由于外源微生物大量介入,导致外源或煤矸石中微生物部分死亡,从而增加了煤矸石有机质含量[22]。也可能是因为接种外源微生物能促进煤矸石形成稳定团聚体,从而减少其有机质流失。冯广达[11]12-15在测定煤矸石对磷的吸附特征时发现,与土壤相比,煤矸石对磷的吸附性强、解吸率低、生物有效性差。因此,煤矸石生态修复时应调节其pH并增加有机质含量,促进生态恢复。

接菌量是与煤矸石肥力直接相关的影响因素。较大接菌量尽管可使细菌在煤矸石中生长迅速,但后期可能因缺乏营养导致细菌生长缓慢甚至死亡,而接菌量太低可能使煤矸石营养利用不充分并导致培养周期延长,感染杂菌概率增大。随着接菌量的不断增加,煤矸石养分含量持续增加,pH逐渐降低,说明接菌量对实验结果影响较大,这与袁向芬等[23]的研究结果相一致。就培养时间而言,当培养时间超过6 d时,煤矸石中碱解氮和有机质的含量呈下降趋势,pH反而升高,这可能与细菌自身生长周期有关。培养周期超过6 d,细菌早已进入衰亡期,导致碱解氮、有机质含量降低；菌液失活,细菌呼吸作用减弱,不再分泌有机酸、释放CO2,导致pH逐渐升高[24]。总之,这可能与细菌复杂的生长代谢过程及营养缺失有关[25]。研究结果表明,30 ℃的培养环境较20、40 ℃时好,可见B1和B2菌株的最适生长温度为30 ℃,培养温度过高或过低均会影响细菌的生长。该培养温度条件与苏辉兰等[26]、陈炫等[27]关于解磷细菌的最适生长温度结果一致。B1和B2菌株在体系初始pH=7.00下更适宜生长,活性较高,能更好地吸附在煤矸石表面,该结果与王美鑫等[28]在NBRIY培养基中培养解磷细菌CoPDB4的最适生长pH相符合。

3.2 不同细菌对煤矸石肥力的强化效果

决定微生物对煤矸石肥力强化效果的影响因素包括煤矸石性质、微生物性质和环境要素[29]。因此,在分析环境要素(接菌量、培养时间、培养温度、体系初始pH)的基础上,从煤矸石及微生物性质层面探究B1、B2菌株与煤矸石之间的作用机制。不同影响因素、3种处理下煤矸石pH的影响总体表现为B1B2>对照。吸附实验及SEM表明,两株细菌主要吸附于煤矸石表面,并随着吸附时间的延长呈现出先升后降的趋势,且总体上B1菌株的吸附量高于B2。细菌对煤矸石的吸附作用是在煤矸石表面发生的,因此煤矸石表面性质对吸附作用有着极其重要的影响[30]。YANG等[31]研究表明,若微生物和矿物的表面电性有助于微生物吸附,则微生物必定可吸附于矿物表面。Zeta电位结果表明,在体系初始pH=7.00的前提下B1菌株与煤矸石的电位差高于B2,更有效地吸附于煤矸石表面。FT-IR分析表明,在细胞层面上B2菌株的稳定性强于B1,所以吸附性低于B1,这与吸附实验、Zeta电位结果相符合。因此,可从煤矸石和微生物性质层面得出B1菌株的解磷效果优于B2。

4 结 论

(1) 相较于对照,实验组样品pH有效降低,有效磷、速效钾、碱解氮、有机质含量均得到不同程度的提高,说明接种微生物可改善煤矸石养分含量,煤矸石的肥力提高。

(2) 相同条件下,3种处理的影响效果总体表现为B1>B2>对照。通过吸附实验及SEM、Zeta电位、FT-IR表征手段分析作用机理得出,B1菌株对煤矸石的处理效果优于B2。

(3) 通过比选,接菌量为150.0 mL、培养6 d、体系初始pH=7.00、培养温度为30 ℃,B1处理下煤矸石养分提升最明显,有效磷、速效钾、碱解氮、有机质含量较对照显著提高了4.98、1.17、1.16、0.32倍,pH降低了0.41。