高效安全的核酸染料在琼脂糖凝胶电泳中的应用

杨 萍， 陆嘉伟， 李翠环

（浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，杭州 311300）

0 引言

琼脂糖凝胶电泳是DNA片段分离、检测最常用的技术之一［1］，也是高校生物类专业实践教学的重要环节。核酸染料与琼脂糖凝胶中DNA片段结合后，在特定光谱照射下发出荧光条带，从而指示DNA片段大小和质量。溴化乙锭（EB）是琼脂糖凝胶电泳最早使用也是最常用的核酸染料，其含有一个插入DNA堆积碱基之间的三环平面基团，经艾姆斯实验证实具有高度致癌性和致突变能力，对长期使用EB的实验人员和环境存在危害性［2］。随着对核酸染料研究的深入以及化学合成技术的发展，近几年一些新型核酸染料已上市，其中SYBR Green I、GeneFinder和4s Green plus属于花青素类［3-5］；GeneGreen［6］和GeneRed是以花菁为根基将苯环改良成链式结构的油性大分子，GeneRed是TIANGENE公司开发的新型核酸染料，上市不久相关文献报道不多；SYBR Safe化学结构与噻唑橙非常相似［7］；Goldview是吖啶橙类核酸染料［8］；GelRed和GelGreen均为二聚体的插层染料，具有独特的油性和大分子量特点，与DNA结合的亲和力比单体大很多［9］。在琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段过程中会出现核酸染料与部分DNA片段结合后发生电泳条带迟滞或变形现象，这样就造成目的基因片段鉴定的不确定性［10］。核酸染料的灵敏度与其在光谱下显示的荧光信号强弱息息相关。有研究表明，EB灵敏度高于SYBR Green I和Gold View，但也有实验证明SYBR Green I灵敏度高于EB［11］，出现这样灵敏度结果不一致的原因一方面与DNA片段大小有关；另一方面受到染色方式的影响。胶染法是琼脂糖凝胶电泳中最普遍的电泳染色方式，GeneFinder的胶染法效果明显优于泡染法和预染法［12］。另外，众多文献资料和实验指导教材很少标明琼脂糖凝胶电泳过程中核酸染料的浓度和使用量，因此核酸染料量化使用需要进一步探索。

本文通过琼脂糖凝胶电泳的染色效果、灵敏度、染色方式和核酸染料的安全性以及性价比等方面对EB和9种新型核酸染料进行综合评价，试图寻找高效安全的核酸染料替代EB在琼脂糖凝胶电泳中的应用。提倡在保证实验结果的前提下尽量减少核酸染料的使用量，从实验室污染的源头抓起，减少对人体和环境的危害。

1 材料与方法

1.1 试验材料

核酸染料：Gelred、GelGreen（Biotium公司），SYBR Green I、4s Green Plus（上海源叶生物科技有限公司），GeneGreen、GeneRed（天根生化科技有限公司），GeneFinder（厦门致善生物科技有限公司），GoldView（承勒科技有限公司），EB、SYBR Safe（APExBIO公司）。

核酸染料原始浓度为10000×，用1×TAE缓冲液按照10000∶1、10000∶0.5、10000∶0.2比例稀释，轻轻震荡混匀，使核酸染料最终浓度为1×、0.5×和0.2×，避光低温贮存。DL5000DNA Marker（TAKARA公司，5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100 bp）。

1.2 实验方法

1.2.1 胶染法

（1）取20 mL、1.5%琼脂糖凝胶与2 μL、1×核酸染料充分混合后制胶，待胶室温充分凝结后，将DL5000DNA Marker以5、10、20、30、40、50 ng量点样于胶孔中。电泳参数为电压125 V，电泳时间40 min；观察核酸染料的染色效果。

（2）取20 mL、1.5%琼脂糖凝胶，分别加入2 μL的1×、0.5×、0.2×核酸染料充分混合后制胶，待胶室温充分凝结后，将DL5000DNA Marker以5、10、20、30、40、50 ng量点样于胶孔中。电泳参数为电压100 V，电泳时间50 min；观察核酸染料的灵敏度。

1.2.2 泡染法

取4 μL、1×核酸染料与40 mL、1×TAE缓冲液混匀制备成泡染液，避光低温贮存。制备N块20 mL、1.5%琼脂糖凝胶，将DL5000DNA Marker以5、10、20、30、40、50 ng量点样于胶孔中，电泳参数同上述胶染法（1），电泳后的凝胶完全浸泡到泡染液中，暗处泡染60 min，依次更换电泳后琼脂糖凝胶，观察连续泡染N次后核酸染料的染色效果。

1.2.3 预染法

制备20 mL、1.5%琼脂糖凝胶，将DL5000DNA Marker以5、10、20、30、40、50 ng量分别与1 μL、1×核酸染料和1×TAE缓冲液预先混匀后，点样于胶孔中，电泳参数同上述胶染法（1），观察核酸染料的染色效果。

2 结果与讨论

2.1 核酸染料的染色效果与灵敏度

2.1.1 核酸染料的染色效果

核酸染料的胶染法染色效果见图1。不同核酸染料与DNA片段结合后电泳迁移率差异较大，EB、GeneGreen和GelGreen的DNA片段迁移率较快，4s green plus的DNA片段相对迟滞，GelRed和GeneRed的DNA片段迁移率相差不大。随着DL5000DNA Marker上量样增加，电泳条带的亮度增大，GelRed、GeneRed、GelGreen、GeneGreen、4s green plus、Goldview和EB均检测到DL5000DNA Marker所有条带，条带清晰易辨（图1中6泳道）；SYBR Green I显示的1000 bp片段条带发生明显前移或“拖尾”现象，GelGreen、GeneGreen和GeneRed显示的1000 bp片段条带发生轻微前移或变形（图1中4～6泳道）；马强等［6］在含GeneGreen的琼脂糖凝胶电泳中观察到类似情况。SYBR Safe检测不到100～250 bpDNA小片段条带（图1（c））；GeneFinder显示500 bp以上DNA大片段条带模糊不清（图1（d））；Goldview电泳背景噪性相对较高（图1（b）），这与王洪梅等［13］的研究结果一致。

图1 不同核酸10种染料的凝胶电泳染色效果

可见，EB和9种新型核酸染料的染色效果差异较大。主要原因是核酸染料的化学特性决定了与DNA片段结合方式和程度存在差异［9］，其次核酸染料的浓度过高会造成电泳部分条带迟滞或变形。

2.1.2 核酸染料的灵敏度

采用胶染法，将核酸染料（1×、0.5×、0.2×）与DL5000DNA Marker（5、10、20、30、40、50 ng）交叉考量核酸染料的灵敏度，电泳时间50 min，略长。结果显示GelRed的灵敏度最好，0.2×GelRed可以清晰显示5 ng DNA marker所有DNA条带5000～100 bp（图2）；GeneRed的灵敏度次之，0.5×GeneRed可以清晰显示10 ng DNA marker所有条带5000～100 bp（图3）。GelRed、GeneRed属于二聚体插层染料，与DNA片段结合的亲和力高于单体核酸染料，其灵敏度较高。余虹莹等［14］认为20×或30×Gelred适合3%琼脂糖凝胶电泳，其结论仅显示为PCR反应产物的条带。与GelRed、GeneRed相比，其他核酸染料的灵敏度较弱。当减少核酸染料用量时，即核酸染料稀释浓度为0.5×、0.2×，EB、GoldView可以显示1000～5000 bp大片段条带，但100～500 bp小片段条带模糊不清，SYBR Green I则相反；GelGreen、GeneGreen、4s Green Plus和GeneFinder只能显示部分DNA片段的条带；SYBR Safe的电泳条带几乎观察不到，说明SYBR Safe核酸染料灵敏度相对最弱，已有的研究表明SYBR Safe灵敏度只有GelGreen的1/3［9］。

图2 GelRed胶染法灵敏度实验电泳图

图3 GeneRed胶染法灵敏度实验电泳图

本文在研究核酸染料灵敏度过程中不仅探索DNA上样量和相对分子质量的敏感特性，还关注了核酸染料的化学特性与最小使用量；在不影响电泳结果的基础上，降低核酸的使用量可以减少对实验人员和环境的危害。

2.2 染色方法的比较

不同核酸染料的连续泡染效果相差较大。EB在连续泡染5块胶后电泳条带变模糊，GoldView可以连续泡染3块胶，GelRed和GeneRed可以连续泡染2块胶，其余核酸染料采用泡染法几乎不显示DNA条带。与胶染法相比，采用连续泡染法可以提高EB利用率，但电泳加染色时间相对较长；另外，考虑到核酸染料容易降解，需要避光。GoldView、GelRed和GeneRed泡染效果一般，其他核酸染料泡染法的染色效果和灵敏度相对差，均不适合泡染法。

预染法是将DNA和核酸染料先混合上样后再电泳。结果显示GelGreen、GeneFinder和SYBR Green预染法显示出部分DNA条带，其他核酸染料显示的条带模糊或没有显示DNA条带。相对胶染法和泡染法，预染法电泳染色效果差、灵敏度不佳且核酸染料使用量大，因此通常琼脂糖凝胶电泳方式很少采用预染法。

2.3 核酸染料的安全性分析

核酸染料的安全性与其渗透细胞膜能力与有一定相关性［9］。EB已被证实具有高度致癌性和致突变能力。GelRed、GelGreen、GeneRed和GeneGreen均具有独特的油性大分子特点，不能穿透细胞膜进入细胞内，其中GelRed、GelGreen水溶剂已经通过美国环保局安全认定，其废弃物可以直接倒入下水道，不会对环境造成任何污染，安全性相对较高［15］。但余文等［16］在研究核酸染料的细菌回复突变实验中发现，这些无法穿透细胞膜的核酸染料在高浓度情况下也会呈现致变性几率；SYBR Green I和SYBR Safe对鼠伤寒沙门菌产生有明显的突变能力；Goldview穿透性强，具有一定的突变性，并对皮肤和眼睛具有一定的刺激性［13］。4s Green plus和GeneFinder的诱变性虽然低于EB，但能引起有机体突变。因此在琼脂糖凝胶电泳过程尽量使用浓度较低、灵敏度高的核酸染料GelRed才会更加安全。实际上目前商用核酸染料并非商家宣传的无毒性，实验人员在使用过程中还需做好自我防护。

2.4 核酸染料价格比较

目前核酸染料在高校生物类实验室已广泛应用，其使用量逐渐增加，控制成本也是需要解决的关键点。通过市场调研核酸染料的价格，按照每块琼脂糖凝胶（20 mL）中染料成本来算，SYBR GreenI成本为3.4元，相对较贵；GelRed、GelGreen、4s Green Plus、GeneRed、GeneGreen和SYBR Safe成本均为1.2元左右，价格适中；GeneFinder成本为0.6元，相对便宜；GoldView和EB成本0.16元左右，价格最廉价。从核酸染料灵敏度实验结果发现，在不影响实验结果的情况下，高灵敏性的GelRed可以通过减少使用量来降低使用成本。

3 结语

本文选取EB和9种新型核酸染料，通过琼脂糖凝胶的染色效果、灵敏度、染色方式和核酸染料的安全性、性价比等方面进行综合评价（见表1）。结果表明采用胶染法，GelRed的电泳染色效果、灵敏度和安全性方面俱佳，其性价比合理，作为EB替代染料值得在高校生物类实验室推广应用。相比之下，GeneRed安全性和灵敏度略有逊色；GeneGreen、GelGreen灵敏度不佳；GeneFinder、SYBR Safe和4s Green Plus染色效果一般、灵敏度较差，它们致突变性虽然低于EB，但还具有一定的毒性；GoldView和SYBR GreenI突变性较强，安全性较差；SYBR GreenI稳定性欠佳并且价格贵，不建议在琼脂糖凝胶电泳中使用，但它与双链DNA结合后，其荧光强度会显著增加，已成为定量PCR的标志性染料［17］。本研究发现不同大小的DNA片段与核酸结合灵敏度存在差异性，因此实验人员可以根据目的基因片段来选择核酸染料的品种和使用量。胶染法具有操作便捷，灵敏度高、核酸染料使用量少等优点，依然推荐为琼脂糖凝胶电泳最常用的电泳方式。

表1 核酸染料综合评价

目前核酸染料的应用范围不再局限于琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段。1×GelRed适合在聚丙烯酰胺凝胶电泳中检测PCR产物［14］；GeneFinder［18］、SYBR GreenI［3］可以定量检测水和土壤中Hg2+。随着核酸染料在高校生物类实验室大量广泛使用，应进一步加强核酸染料使用后废胶的规范处理，避免污染环境，保证高校实验室安全、环保和可持续发展。