盐度胁迫对红娇凤凰螺耗氧率、排氨率以及免疫相关酶活性的影响

陈 旭 ，赵 旺 ，陈明强 ，谭春明 ，于 刚

1. 中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心/三亚热带水产研究院，海南 三亚 572018

2. 农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 510300

3. 海南省深远海渔业资源高效利用与加工重点实验室，海南 三亚 527018

红娇凤凰螺 (Strombus luhuanus) 又名篱凤螺、红口螺，隶属于软体动物门、腹足纲、中腹足目、凤螺总科、凤螺科。分布于热带和亚热带海区，常栖息于潮间带至水深36 m处的岩砾底或砂底。红娇凤凰螺是植食性软体动物，以各种藻类和有机碎屑为食。其肉可食，贝壳形状奇特，壳色鲜艳有光泽，可供观赏，也可制作装饰品，经济价值较高[1]。近年来，由于过度捕捞和环境污染加重，红娇凤凰螺生存的近海水质和生态环境不断恶化，其渔获量急剧降低，价格逐年攀升[2]。据统计，2019年约20 g的红娇凤凰螺市场价格高达60元·kg–1，养殖利润十分可观。

在沿海地区，由于潮汐、降水、高温干旱或人类活动等诸多因素的影响，海水盐度经常会发生不同程度的波动。这种变化会在一定程度上影响贝类的呼吸代谢和酶活性[3]，最终导致其生长缓慢、死亡率升高[4-5]。呼吸和排泄是贝类重要的生理活动，耗氧率、排氨率是反映贝类呼吸代谢水平的重要指标，其变化情况反映了盐度对贝类正常生命活动的影响程度[6-7]。在正常的生理条件下，贝类体内抗氧化防御系统中超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶类，可以帮助清除体内的活性氧自由基(ROS)，增强贝类的抗氧化和免疫能力，保护机体免受氧化胁迫的损伤。同时，溶菌酶 (LZM) 是贝类非特异性免疫系统中重要的免疫酶之一，这些酶的活性是贝类生理和免疫状况的重要指标[8-9]。近年来，已经在方斑东风螺 (Babylonia areolata)[10]、缢蛏 (Sinonovacula constricta)[11]、菲律宾蛤仔 (Ruditapes philippinarum)[12]、大竹蛏 (Solen grandis)[13]、近江牡蛎 (Crassostrea ariakensis) 和长牡蛎 (C. gigas)[14]等多种贝类中开展了盐度对贝类的影响研究，这些研究证实了盐度变化会对海洋贝类耗氧率、排氨率或免疫相关酶活性产生显著影响。然而，有关盐度胁迫对红娇凤凰螺耗氧率、排氨率以及免疫相关酶活性的影响尚未见报道。因此，本研究采用不同盐度处理，以红娇凤凰螺耗氧率、排氨率、肝胰脏和肌肉CAT、总超氧化物歧化酶 (T-SOD)、过氧化物酶 (POD) 以及LZM活性的变化为参考指标，探索盐度胁迫对红娇凤凰螺耗氧率、排氨率以及免疫相关酶活性的影响，以期探明红娇凤凰螺的耐盐性机制，为完善其人工养殖技术、活体运输和抗盐新品种的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用红娇凤凰螺来自海南三亚西岛海域 (水深22～26 m、水温28.5 ℃、盐度31)，在中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心 (海南陵水) 基地进行实验。实验前，红娇凤凰螺暂养7 d，养殖密度100～150 个·m–2，期间投喂浒苔 (Ulva lactuca)，实验前 24 h 停止投喂，选择规格相近、活力好、体表无破损的个体进行实验，实验用红娇凤凰螺平均体质量为 (28.08±1.30) g。

CAT、T-SOD、POD和LZM试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。实验淡水为经过曝气24 h后的自来水，水质指标如下：水温 28.1 ℃、pH 7.15、氨氮 0 mg·L–1、亚硝酸盐0 mg·L–1。海水为经过沙滤后的自然海水，水质指标如下：盐度 32、pH 7.92、氨氮＜0.01 mg·L–1、亚硝酸盐＜0.02 mg·L–1。

1.2 实验方法

1.2.1 耗氧率、排氨率实验

参照文献[14]的设计，红娇凤凰螺放入自然海水 (盐度为32) 中，每天升高或降低1～2个盐度，实验用水分别用海水与淡水或海盐进行配制。达到实验设定盐度后再驯化7 d，开始实验。设置盐度17、22、27、32和37共5组，其中32为对照组。每组设5个重复，每个重复放螺1个，3个空白呼吸瓶 (不放螺) 作为对照，在1 000 mL三角锥形瓶中进行。实验采用静水法，水浴控温 (28±0.5) ℃，用保鲜膜和皮筋封口，持续时长为6 h。

1.2.2 盐度胁迫实验

根据预实验结果，把暂养在自然海水中7 d后的红娇凤凰螺移入室内塑料桶 (250 L) 内进行胁迫实验，每桶水体积约为100 L。实验同样设置与上述相同盐度梯度组，每组设4个重复，每个重复放螺30个。实验持续24 h，期间不间断充气。

1.3 样品采集、分析和计算

采集红娇凤凰螺的肝胰脏和肌肉立刻于–80 ℃冻存备用。样品分析前于4 ℃冰箱中解冻，用DREAMEL研磨仪研磨，后放入EXPERT 18K-R冷冻离心机，4 ℃、2 500 r·min–1离心 10 min，取上清液用于 CAT、T-SOD、POD及LZM活性的测定。测定操作详见南京建成生物工程研究所研发的试剂盒使用说明书，在多功能酶标仪 (美国伯腾Biotek Synergy H1) 中测定吸光值，换算成相应浓度或酶活值。

虹吸法采集水样，根据GB 17378.4—2007《海洋监测规范第4部分 ：海水分析》，分别采用Winkler 碘量法和次溴酸钠氧化法测定水中的溶解氧 (DO) 和氨氮 (NH3-N) 质量浓度。耗氧率和排氨率通过下式计算：

式中：OCR、AER 分别为单位体质量的耗氧率［mg·(g·h)–1］和排氨率［mg·(g·h)–1］；D0、D1分别为实验初始和实验结束后的DO质量浓度 (mg·L–1)；N0、N1分别为实验初始和实验结束后NH3-N质量浓度 (mg·L–1)；V为呼吸瓶体积 (L)；W为红娇凤凰螺软体部干质量 (g)；t为实验持续时间 (h)。

1.4 数据处理

2 结果

2.1 红娇凤凰螺耗氧率、排氨率

红娇凤凰螺耗氧率和排氨率随着胁迫盐度的升高均呈先升后降的变化趋势 (图1)，对照组耗氧率和排氨率均为最高，且显著高于其他各实验组 (P＜0.05)。各组组间耗氧率差异均显著 (P＜0.05)，其中，盐度37组显著高于17、22和27组 (P＜0.05)；盐度27组显著高于22和17组 (P＜0.05)；盐度22组显著高于17组 (P＜0.05，图1-a)。盐度37组排氨率显著高于17、22和27组 (P＜0.05)；盐度27组显著高于22和17组 (P＜0.05)；盐度22和17组组间差异不显著 (P＞0.05，图 1-b)。

图1 盐度胁迫对红娇凤凰螺耗氧率、排氨率的影响注：不同字母表示各组间存在显著差异 (P＜0.05)，下同。Fig. 1 Effect of salinity stress on oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of S. luhuanusNote: Different letters indicate significant difference among groups (P＜0.05). The same below.

2.2 肝胰脏CAT、T-SOD、POD和LZM的活性

随着胁迫盐度的增加红娇凤凰螺肝胰脏CAT活性总体呈降低-升高-降低-升高的不规则变化 (图2)。其中，对照组CAT活性最低，与盐度22组差异不显著，但均显著低于其他各盐度组 (P＜0.05，图2-a)。红娇凤凰螺肝胰脏T-SOD活性无显著差异 (P＞0.05，图2-b)。盐度胁迫下，对照组、盐度27和37组组间POD活性差异不显著，但均显著高于盐度17和22组 (P＜0.05)；盐度17与22组差异不显著 (图2-c)。随着盐度的增加肝胰脏LZM活性呈现先升后降的变化趋势。其中，对照组LZM活性最高，显著高于各实验组 (P＜0.05)，但各实验组组间差异均不显著 (图2-d)。

图2 盐度胁迫对红娇凤凰螺肝胰脏免疫酶活性的影响Fig. 2 Effect of salinity stress on immunoenzyme activities of hepatopancreas of S. luhuanus

2.3 肌肉CAT、T-SOD、POD和LZM的活性

随着胁迫盐度的增加红娇凤凰螺肌肉CAT活性呈现先升高后降低趋势 (图3)。其中，盐度22组CAT活性最高，显著高于盐度37组 (P＜0.05)，但与其他各组差异均不显著；其他各组组间差异均不显著 (P＞0.05，图3-a)。红娇凤凰螺肌肉T-SOD活性在实验过程中无显著差异 (P＞0.05，图3-b)。盐度胁迫下，各实验组组间POD活性差异不显著，均显著高于对照组 (P＜0.05，图3-c)；对照组LZM活性最高，显著高于各实验组 (P＜0.05)，盐度22、27和37组组间差异不显著，均显著高于盐度17组 (P＜0.05，图3-d)。

图3 盐度胁迫对红娇凤凰螺肌肉免疫酶活性的影响Fig. 3 Effect of salinity stress on muscle immunoenzyme activities of S. luhuanus

3 讨论

3.1 盐度胁迫对红娇凤凰螺耗氧率、排氨率的影响

盐度是海洋生态系统中重要的生态因子，影响着贝类的分布和其生理代谢[15-16]。耗氧率和排氨率是水生生物有氧代谢的重要指标，研究贝类的耗氧率和排氨率有助于了解其新陈代谢活动的规律和变化特点，也能够反映盐度环境条件对其生理活动的影响，是水生动物生理学研究的重要内容之一[7,13,17-18]。本研究结果表明，盐度变化对红娇凤凰螺耗氧率和排氨率均有显著影响。盐度在17～32时，耗氧率和排氨率随着盐度的升高而增大；盐度为32时均达到最高值；当盐度大于32时，耗氧率和排氨率均随盐度的升高而下降。这一研究结果与泥螺 (Bullacta exarata)[19]、香螺 (Naptunea cumingii)[20]幼螺、岩扇贝 (Crassadoma gigantea)[21]幼贝的结果相似，即贝类的耗氧率和排氨率随着盐度的升高而上升，在某盐度范围内达到最大值后，随盐度的升高而降低。这说明在超出红娇凤凰螺适应的海水盐度范围后，其为了适应高、低盐度的水环境而调整生理代谢活动，例如通过主动关闭进、出水管或腹足收缩到贝壳内，将机体与外部环境隔离，从而降低耗氧率和排氨率来适应周围环境渗透压的变化[14,20]。研究发现，泥蚶(Tegillarca granosa)耗氧率和排氨率随着盐度的升高先降低后升高，但各实验组间差异并不显著[22]；盐度对僧帽牡蛎(Saccostrea cucullata)排氨率的影响不显著[17]；九孔鲍 (Haliotis diversicolor supertexta)在盐度21～36范围内耗氧率呈持续升高趋势，排氨率在实验盐度范围内也呈持续升高趋势[23]。另有研究表明，盐度急性应激后，高盐区缢蛏的耗氧率和排氨率高于低盐区[24]。这些结果可能与物种亲缘关系的远近对盐度适应范围不同以及贝类自身的生理特性相关[25]。

3.2 盐度胁迫对红娇凤凰螺肝胰脏和肌肉免疫相关酶活性的影响

贝类体内不存在特异性免疫细胞和相应的抗体，主要通过有异于脊椎动物的独特免疫机制来抵抗外界病原体的侵入同时进行异己物质的识别[26-27]。在逆境下，生物体内ROS的过量产生会导致脂质过氧化、DNA 损伤、生物膜损伤甚至破坏组织的完整性。正常条件下，贝类体内抗氧化防御系统中的抗氧化酶类，可以清除体内的ROS，增强贝类的抗氧化和免疫能力，保护机体免受氧化胁迫的损伤[6,9,28]。本研究中，盐度胁迫对红娇凤凰螺肝胰脏和肌肉T-SOD活性的影响在实验过程中无统计学意义。这表明红娇凤凰螺肝胰脏和肌肉内正常产生的SOD可完全将盐度胁迫产生的ROS分解成过氧化氢 (H2O2)，从而维持机体内ROS“稳态性动态平衡”[29-30]。盐度胁迫下，与对照组相比，各实验组肝胰脏CAT活性均有不同程度的升高，而肌肉各实验组CAT活性与对照组差异均不显著。说明机体受到盐度胁迫产生了大量的ROS，通过氧化还原反应进行多层次应激性调节和信号转导，导致肝胰脏CAT活性升高以清除过量的ROS。应激诱导机体产生了大量的ROS，导致脂质过氧化反应增强，脂质的过氧化物也随之增多。机体抗氧化防御体系反应，导致POD活性升高以对抗氧化应激。而低盐 (17和22) 胁迫下，肝胰脏POD活性降低的原因可能是机体清除胁迫所产生的过多ROS消耗了大量的POD或ROS超过抗氧化体系处理的阈值，机体组织受到了严重损伤，造成POD活性降低。同时，不论是高盐还是低盐胁迫，肝胰脏和肌肉对照组LZM活性均显著降低，这势必会降低红娇凤凰螺杀灭和消化细菌的能力，在这种情况下红娇凤凰螺很容易受到环境中的致病菌侵袭而死亡。研究发现，胁迫24 h后，方斑东风螺体内CAT活性随着盐度的升高显著上升，T-SOD活性呈“抑制-诱导-抑制”的变化趋势[10]；近江牡蛎血淋巴随着盐度的升高SOD活性呈“抑制-诱导-抑制”的变化趋势，CAT活性先升高后降低，LZM活性随着盐度的升高先上升后降低[31]。岩牡蛎(C. nippona) 鳃组织SOD活性在盐度24内随着盐度的升高而升高，然后随着盐度的升高出现“降低-升高-降低-升高”的不规则变化；CAT活性在16～24范围内随着盐度的升高而升高，在32～40范围内随着盐度的升高而降低；LZM活性则出现“锯形”不规则变化[32]。这些研究表明，高盐或低盐胁迫24 h后，贝类不同组织免疫相关酶活性均有所变化，但与盐度变化不呈线性关系，而且在不同物种中未表现出相似的规律性，这可能是不同贝类生理特性不同以及对环境胁迫的耐受力有所差异所致。因此，开展对红娇凤凰螺耗氧率、排氨率以及免疫相关酶活性的研究不仅有利于提高其自身的抗病能力和为培育耐盐新品系提供科学依据，同时对其他贝类免疫机制的研究具有重要的理论和实际意义。

综上所述，本研究通过耗氧率、排氨率以及4种免疫相关酶活性的变化情况对红娇凤凰螺的耐盐性进行了初步分析，结果表明，在本实验条件下，盐度胁迫提高了红娇凤凰螺肝胰脏CAT、肌肉POD活性，降低了耗氧率、排氨率，并造成LZM活性降低，导致红娇凤凰螺杀灭和消化细菌的能力降低。目前盐度对海洋无脊椎动物免疫力影响的机理尚不清楚，无脊椎动物非特异性免疫系统是如何应对病原体侵染、如何进行应激性调节和信号转导以及是否存在其他物质的参与和协调等尚需深入研究[33-34]。