液液萃取-高效液相色谱法测定地表水中多环芳烃

王 颖

（广东朴华检测技术有限公司，广东 梅州 514733）

多环芳烃是指含两个或两个以上苯环的芳烃[1]，简称PAHs，主要有两种组合方式，一种是非稠环型，其中包括联苯及联多苯和多苯代脂肪烃；另一种是稠环型，即两个碳原子为两个苯环所共有[2]。多环芳烃的来源分为自然源和人为源。自然源主要来自陆地、水生植物和微生物的生物合成过程，另外森林、草原的天然火灾及火山的喷发物和化石燃料、木质素及底泥中也存在多环芳烃；人为源主要是由各种矿物燃料（如煤、石油和天然气等）、木材、纸以及其他含碳氢化合物的物质不完全燃烧或在还原条件下热解形成[2]。PAHs由于具有毒性、遗传毒性、突变性和致癌性[3]，可对人的呼吸系统、循环系统、神经系统造成损伤，对肝脏、肾脏造成损害[4]，被定为影响人类健康的主要有机污染物[3]。

1 多环芳烃的检测方法

目前多环芳烃的检测方法主要是气相色谱-质谱联用法和高效液相色谱法。环境监测水中的多环芳烃检测方法为《水质 多环芳烃的测定 液液萃取和固相萃取高效液相色谱法》（HJ 478-2009）[5]，但其中16种多环芳烃的分离效果不佳。本文通过参考该方法优化洗脱程序，成功分离16种多环芳烃后，对方法进行验证。

2 实验部分

2.1 试剂和材料

乙腈（CH3CN）：液相色谱纯；甲醇（CH3OH）：液相色谱纯；二氯甲烷（CH2Cl2）：液相色谱纯；正己烷（C6H14）：液相色谱纯；硫代硫酸钠（N2S2O3·5H2O）；无水硫酸钠（Na2SO4）：在400℃下烘烤2 h，冷却后，贮于磨口玻璃瓶中密封保存；氯化钠（NaCl）：在400 ℃下烘烤2 h，冷却后，贮于磨口玻璃瓶中密封保存；多环芳烃标准贮备液（200 μg/mL）：含16种多环芳烃的乙腈溶液，贮备液于4 ℃以下冷藏；弗罗里硅土柱：1 000 mg/6.0 ml。

2.2 仪器和设备

赛默飞U3000型高效液相色谱仪：配备紫外检测器，具有梯度洗脱功能；色谱柱：填料为5 µm ODS，柱长250 mm，内径4.6 mm的反相色谱柱；浓缩装置：上海全浦QP-D0Y-24Y圆形水浴氮吹仪和上海精密RE-201D 旋转蒸发仪；聚四氟乙烯分液漏斗：2 000 mL。

2.3 样品的采集与保存

样品必须采集在预先洗净烘干的采样瓶中，采样前不能用水样预洗采样瓶，防止样品的沾染或吸附；采样瓶要完全注满，不留气泡；若水中有残余氯存在，要在每升水中加入80 mg硫代硫酸钠除氯；样品采集后应避光于4 ℃以下冷藏，在7 d内萃取，萃取后的样品应避光于4 ℃以下冷藏，在40 d内分析完毕[5]。

2.4 样品前处理

2.4.1 萃取

摇匀水样，量取1 000 mL水样，倒入2 000 mL的分液漏斗中，加入30 g氯化钠，再加入50 mL二氯甲烷，振摇5 min，静置分层，收集有机相，放入250 mL接收瓶中，重复萃取两遍，合并有机相，加入无水硫酸钠至有流动的无水硫酸钠存在；放置30 min，脱水干燥[5]。若萃取过程中出现乳化现象，可使用搅动、离心、用玻璃棉过滤等方法破乳，也可使用冷冻的方法破乳[5]。

2.4.2 浓缩

用旋转蒸发仪浓缩至1 mL，加入适量正己烷至5 mL，重复此浓缩过程3次，最后浓缩至1 mL，待净化[5]。

2.4.3 净化

将弗罗里硅土柱固定在净化装置上；先用4 mL二氯甲烷/正己烷（1+1）混合溶液冲洗净化柱，再用10 mL正己烷平衡净化柱，当2 mL正己烷流过净化柱后，关闭活塞，使正己烷在柱中停留5 min；将浓缩后的样品溶液加到柱上，再用约3 mL正己烷分3次洗涤装样品的容器，将洗涤液一并加到柱上，弃去流出的溶剂；被测定的样品吸附于柱上，用10 mL二氯甲烷/正己烷（1+1）洗涤吸附有样品的净化柱，收集洗脱液于浓缩管中，当2 mL洗脱液流过净化柱后关闭活塞，让洗脱液在柱中停留5 min；用水浴氮吹仪将其浓缩至0.5 mL～1.0 mL，加入3 mL乙腈，再浓缩至1 mL以下，最后准确定容到1 mL待测[5]。若预处理过程中溶剂转换不完全，即有残存正己烷或二氯甲烷，在样品分析时会出现保留时间漂移、峰变宽或双峰的现象[5]。

2.5 色谱条件

进样量：10 µL；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL/min；流动相A：乙腈；流动相B：水。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

紫外检测器的波长为254 nm、220 nm和295 nm，16种多环芳烃在紫外检测器上对应的最大吸收波长见表2。

表2 用紫外检测器检测多环芳烃时对应的波长

2.6 标准曲线的绘制

2.6.1 标准使用液的制备

准确吸取50 μL多环芳烃标准贮备液于1 mL棕色容量瓶中（容量瓶内预先加入少量乙腈，标准物质应加入液面下），用乙腈定容至刻度，混匀后转移到棕色小瓶中保存，该多环芳烃标准使用液浓度为10 μg/mL。

2.6.2 标准系列的制备

取5个1 mL棕色容量瓶，瓶内预先加入少量乙腈，往容量瓶内依次加入多环芳烃标准使用液（10 μg/mL）4 μL、10 μL、50 μL、100 μL 和200 μL，用乙腈定容至刻度，制成多环芳烃质量浓度分别为0.04 µg/mL、0.10 µg/mL、0.50 µg/mL、1.00 µg/mL 和2.00 µg/mL的标准系列，贮存在棕色小瓶中，用封口膜密封，于冷暗处存放。

2.6.3 标准样品的色谱图

图1为在本文规定的色谱条件下，紫外检测器串联的16种多环芳烃标准色谱图。

图1 16种多环芳烃标样的紫外色谱图

3 结果与讨论

3.1 色谱条件优化

由于16种多环芳烃中的苊烯无法产生荧光，本文采用紫外检测器对多环芳烃进行定性定量检测。鉴于16种多环芳烃在紫外检测器上对应的最大吸收波长各不相同，选取254 nm，220 nm 和295 nm作为最佳检测波长。为确定合适的洗脱溶剂和洗脱程序，分别采用甲醇-水（80%甲醇+20%水，保持20 min，以1.2%甲醇/min的增量至95%甲醇+5%水，保持至出峰完毕）和乙腈-水（65%乙腈+35%水，保持27 min，以2.5%乙腈/min的增量至100%乙腈，保持至出峰完毕）作为流动相进行实验，结果显示乙腈-水作为流动相分离效果较好。根据多环芳烃各组分极性和理化性质的不同，逐步调整乙腈和水的比例，使16种多环芳烃实现完全分离，最终确定的梯度洗脱程序见表1；在优化好的色谱条件下对标准溶液检测得到16种多环芳烃色谱图（见图1）。

3.2 线性和检出限

将多环芳烃标准系列通过自动进样器注入高效液相色谱仪，进样量为10 μL，得到不同浓度的多环芳烃色谱图。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。16种多环芳烃的回归方程和相关系数见表3，由此可知，多环芳烃在浓度为0.04～2.00 μg/mL范围内相关系数R2值在0.999以上，均呈现很好的线性关系。使用低浓度多环芳烃标准溶液平行测定7次，根据公式MDL=3.143×S计算检出限，结果见表3。由此可见，按照本文介绍的液相色谱条件，16种多环芳烃可以取得较高的灵敏度，满足日常地表水的监测需求。

表3 16种多环芳烃的回归方程、相关系数和检出限

3.3 精密度与准确度

3.3.1 精密度

取不含多环芳烃的纯水样品添加多环芳烃标准贮备液（200 μg/mL），使用液液萃取法萃取后净化浓缩，最终样品溶液浓缩定容至1.00 mL，分别测定7次，测定结果见表4。

表4 16种多环芳烃的精密度（n=7）

3.3.2 准确度

取不含多环芳烃的纯水和地表水样品添加多环芳烃标准贮备液（200 μg/mL），使用液液萃取法萃取后净化浓缩，最终样品溶液浓缩定容至1.00 mL，分别测定3次，测定结果见表5。由表4、表5可见，加标的纯水样品中，16种多环芳烃相对标准偏差均小于10%，加标的纯水和地表水样品中，16种多环芳烃的回收率为85.0%～103%，方法精密度、准确度均满足水中16种多环芳烃的检测要求。

表5 16种多环芳烃的准确度

4 结论

本文成功建立了液液萃取-高效液相色谱法测定地表水中多环芳烃的分析方法。在对洗脱程序进行优化后，该方法具有较低的检出限、较宽的线性范围、较高的准确度、良好的精密度和加标回收率；满足相关规范要求，简单、快捷、稳定性好，准确、灵敏、可靠，适用于水中16种多环芳烃的检测。