指纹图谱结合化学模式识别评价吉祥草的质量以及高效液相色谱法测定吉祥草中4种化学成分的含量

路瑀璠,阮宝丽,罗夫来,罗春丽,赵 致

(1.贵州大学 农学院,贵阳 550025;2.贵州省药用植物繁育与种植重点实验室,贵阳 550025)

吉祥草Reineckia carnea(Andr.)Kunth为百合科(Liliaceae)吉祥草属(Reineckea Kunth)植物[1],是贵州省苗族地区常用的特色传统草药之一。吉祥草中含有甾体类、黄酮类及萜类化合物等成分[2-6],其主要药效成分为皂苷类化合物[7]。现代药理研究表明,吉祥草具有溶血、抗炎、杀灭钉螺、降糖及抗肿瘤等功效[8-11],常用于肺燥咳喘、阴虚咳嗽等病症[12],是多家制药企业加工生产中成药的主要药材来源。

目前,关于吉祥草质量控制的研究主要集中在化学成分含量的测定[13-15],而从指纹图谱结合化学计量法角度进行吉祥草质量评价研究鲜有报道。因此,本工作以20批吉祥草为研究对象,采用高效液相色谱法(HPLC)建立吉祥草整体特征的指纹图谱,在此基础上,利用化学模式识别对20批吉祥草进行质量差异性评价,筛选差异性成分,同时测定吉祥草中芦丁、人参皂苷Rb1、薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元等4种化学成分的含量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260 infinity型高效液相色谱仪;HH-6型数显恒温水浴锅;RE-52AA型旋转蒸发仪;PX85ZH型电子天平;SB-5200DT型超声波清洗机。

对照品混合溶液:分别称取芦丁对照品6.00 mg,人参皂苷Rb1对照品26.55 mg,薯蓣皂苷对照品1.47 mg,薯蓣皂苷元对照品0.52 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成芦丁、人参皂苷Rb1、薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元质量浓度依次为0.600,2.655,0.147,0.052 g·L-1的对照品混合溶液。

芦丁、人参皂苷Rb1、薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元等对照品的质量分数均大于98%,批号依次为153-18-4、41753-43-9、19057-60-4、512-04-9;甲醇、乙腈、磷酸均为分析纯;试验用水为超纯水。

供试品来自于贵州大学药用植物资源圃,原植物均野生,经贵州大学农学院罗夫来教授鉴定为百合科吉祥草属吉祥草的干燥全草,种质来源及采集时间见表1。

表1 20批吉祥草的种质来源及采集时间Tab.1 Germplasm sources and collection time of 20 batches of Reineckia carnea

1.2 仪器工作条件

Agilent C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱温25℃;流动相A为0.1%(体积分数)磷酸溶液,B为乙腈;流量1 mL·min-1;检测波长203 nm;进样量20μL。梯度洗脱程序:0～25 min时,B由5%升至18%;25～45 min时,B由18%升至25%;45～55 min时,B由25%升至45%;55～75 min时,B由45%升至68%;75～80 min时,B由68%升至100%,保持15 min。

1.3 试验方法

1.3.1 样品分析

将采集到的吉祥草植株晒干、粉碎,过孔径(355±13)μm的筛网。取样品粉末5.000 g,加入75%(体积分数)乙醇溶液40 mL,回流提取两次,每次1.5 h,过滤,合并两次提取液,冷却,摇匀。旋转蒸发回收溶剂至干,残渣用甲醇溶解并定容至10 mL,摇匀,过0.45μm微孔滤膜,即得供试品溶液,按照仪器工作条件进行测定。

1.3.2 数据分析

利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A版)建立20批吉祥草HPLC指纹图谱,并对其进行相似度评价,使用SPSS 26.0软件进行聚类分析和主成分分析,使用SIMCA-P 11.5软件进行偏最小二乘判别分析。

2 结果与讨论

2.1 20批吉祥草HPLC指纹图谱与相似度评价

利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A版),以S1样品为参照图谱,中位数生成法,选取“时间窗宽度”为0.1 min,采用多点校正后进行自动匹配,选择6个点校正Mark峰,生成对照图谱(R)及20批吉祥草HPLC指纹图谱,获得13个共有峰,结果见图1(a)和图1(b)。通过与对照品混合溶液图谱[图1(c)]比较,指认峰5为芦丁,峰11为人参皂苷Rb1,峰12为薯蓣皂苷,峰13为薯蓣皂苷元。

图1 色谱图Fig.1 Chromatograms

20批吉祥草图谱与R的相似度为0.546～0.942,表明吉祥草药材化学成分整体上差异较大;其中S6、S7、S12、S13、S16、S19等6批吉祥草图谱与R的相似度为0.908～0.942,表明这6批吉祥草药材之间的差异较小。

2.2 化学模式识别分析

2.2.1 聚类分析

以20批吉祥草HPLC指纹图谱中13个共有峰的峰面积为变量,运用SPSS 26.0软件进行聚类分析,结果见图2。

由图2可知:当欧氏平方距离为11时,20批吉祥草被分成3类,其中S7、S10、S12、S16、S18、S17、S15、S3、S4、S1、S13、S2、S14、S19、S6、S8、S20、S9聚为第1类,S11为第2类,S5为第3类。

图2 20批吉祥草聚类分析树状图Fig.2 Clustering treemap for 20 batches of Reineckia carnea

2.2.2 主成分分析

Kaiser-Meyer-Olkin(KMO)检验的统计量为0.639,符合统计要求;Bartlett′s球形检验统计量为0,适合主成分分析。主成分分析结果见表2。

表2 特征值和方差贡献率Tab.2 Characteristic values and variance contribution rates

由表2可知:前4个主成分的初始特征值均大于1.000,累积方差贡献率为85.374%,表明这4个主成分代表了吉祥草药材中85.374%的信息量,具有极高的代表性,可用于评价吉祥草药材的质量。

13个共有峰的相关性系数矩阵见表3,其中“*”表示P＜0.05,显著相关;“**”表示P＜0.01,极显著相关。

由表3可知:峰1与峰3、峰5,峰2与峰10、峰12,峰3与峰4,峰4与峰8、峰11,峰5与峰13,峰7与峰13,峰8与峰9、峰11,峰9与峰11之间呈极显著正相关性;峰1与峰4、峰7、峰8、峰13,峰2与峰13,峰3与峰8,峰4与峰9,峰5与峰6、峰7,峰6与峰7之间呈显著正相关性;峰2与峰3、峰4,峰3与峰6、峰7、峰13,峰4与峰6、峰10,峰5与峰12,峰6与峰8、峰9、峰12,峰7与峰11,峰8与峰10,峰9与峰10,峰10与峰11之间呈负相关性,但差异不显著;峰6与峰11之间呈负相关性,差异达显著水平。

表3 相关性系数矩阵Tab.3 Matrix of correlation coefficients

13个共有峰的初始因子载荷矩阵见表4。

表4 初始因子载荷矩阵Tab.4 Initial factor load matrix

由表4可知:峰1、峰4、峰6、峰7、峰11在主成分1上具有较高载荷值,峰8、峰9在主成分2上具有较高载荷值,峰2、峰12在主成分3上具有较高载荷值,峰3、峰8在主成分4上具有较高载荷值,说明这几个成分对吉祥草药材分类影响较大。

根据初始因子载荷矩阵,推测影响吉祥草药材质量差异的并不是单一成分,而是多成分协同作用的结果。利用主成分1～4对20批吉祥草进行综合评价,以Y m(m＝1,2,3,4)表示4个主成分的得分,以F n(n＝1,2…,13)表示共有峰峰面积标准化后的数据,以K p(p＝1,2…,13)表示因子载荷值与特征值开平方后的比值,建立吉祥草药材质量评价模型,根据线性关系通式Y m＝F1×K1＋F2×K2＋…＋F n×K p＋…＋F13×K13,计算20批吉祥草的Y1,Y2,Y3,Y4,结果见表5。

结合主成分1～4的方差贡献率,根据吉祥草药材质量综合评价表达式综合得分＝(Y1×35.090＋Y2×26.656＋Y3×13.195＋Y4×10.433)/85.374,计算20批吉祥草的综合得分,并对其进行排名,结果见表5。

表5 主成分得分和综合得分Tab.5 Principal component scores and comprehensive scores

由表5可知:20批吉祥草中,综合得分较高的是S5和S11,其次是S20、S9和S14。表明S5(贵州安龙)、S11(重庆南岸)这两批吉祥草药材受环境条件的影响较小,相比其余18批吉祥草药材质量较佳。

2.2.3 偏最小二乘判别分析

将20批吉祥草的13个共有峰的峰面积导入SIMCA-P 11.5软件,偏最小二乘判别分析得分图见图3。

由图3可知:20批吉祥草被分为3类,S5、S11各分为一类,S1～S4、S6～S10和S12～S20为一类,与聚类分析结果一致。表明20批吉祥草因种质来源不同,所含有的化学成分种类不同,即使含有相同的化学成分,但其含量有一定的差异性。

图3 20批吉祥草偏最小二乘判别分析得分图Fig.3 Score plot of partial least squares-discriminant analysis for 20 batches of Reineckia carnea

为确定导致20批吉祥草分类差异较大的成分,试验采用变量重要性投影(VIP)法,得到13个共有峰的VIP值,结果见图4。

图4 13个共有峰的VIP值Fig.4 VIP values of 13 common peaks

以VIP值大于1为标准,筛选出7个差异性成分,分别为峰13(薯蓣皂苷元)、峰2、峰7、峰5(芦丁)、峰12(薯蓣皂苷)、峰1和峰6。

2.3 化学成分含量的测定

2.3.1 标准曲线和检出限

精密移取对照品混合溶液4.0,8.0,12.0,16.0,20.0μL,按照仪器工作条件直接进样分析。以芦丁、人参皂苷Rb1、薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元的质量为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线,线性参数见表6。

以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),结果见表6。

表6 线性参数和检出限Tab.6 Linearity parameters and detection limits

2.3.2 仪器精密度试验

按照1.3.1节试验方法对S2供试品溶液连续进样6次,计算得芦丁、人参皂苷Rb1、薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为1.3%,1.1%,1.4%,1.1%,说明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验

按照1.3.1节试验方法对6份S2供试品溶液进行分析,计算得芦丁、人参皂苷Rb1、薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元峰面积的RSD分别为1.8%,1.4%,1.1%,2.1%,表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验

按照1.3.1节试验方法制备S2供试品溶液,分别于0,4,8,12,16,20,24 h进样分析,计算得芦丁、人参皂苷Rb1、薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元峰面积的RSD分别1.6%,0.79%,2.2%,1.1%,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.5 回收试验

精密称取S2样品6份,每份5.000 g,各加入芦丁2.00 mg、人参皂苷Rb1 3.52 mg、薯蓣皂苷0.09 mg、薯蓣皂苷元0.05 mg,按照1.3.1节试验方法进行加标回收试验,计算回收率和测定值的RSD。结果显示,芦丁、人参皂苷Rb1、薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元的回收率分别为100%,98.5%,102%,97.4%,测定值的RSD分别为2.6%,1.4%,2.1%,1.1%。

2.3.6 样品分析

按照试验方法分析20批吉祥草,每个样品重复分析3次,结果见表7。

由表7可知,20批吉祥草中芦丁、人参皂苷Rb1、薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元的测定值分别为0.249～0.984 mg·g-1,0.431～5.851 mg·g-1,0.007～0.261 mg·g-1和0.003～0.095 mg·g-1,人参皂苷Rb1含量较高,薯蓣皂苷元含量较低,20批吉祥草中各成分含量具有差异。推测造成此差异的原因可能是药材种质来源的不同或药材受当地的气候条件和环境因素影响,但具体影响因素还需进一步调查研究。

表7 样品分析结果Tab.7 Analytical results of the samples

本工作以20批吉祥草为研究对象,建立了HPLC指纹图谱,选取其中的13个共有峰进行了相似度评价、聚类分析、主成分分析及偏最小二乘判别分析,通过综合评价,建立了吉祥草药材的质量评价方法,在一定程度上可为吉祥草药材的质量控制、质量标准制订及民间、临床安全用药提供参考。