异硫氰酸异丁酯抑制肝癌细胞HepG2生长的效应与机理

周巧巧，匡政坤，张洪权，熊 丽，周诗毅*

(1.湖北第二师范学院化学与生命科学学院， 武汉 430205 ；2.湖北第二师范学院化学与生命科学学院植物抗癌活性物质提纯与应用湖北省重点实验室， 武汉 430205；3.华中师范大学生命科学学院， 武汉 430079)

2021年美国新增肝癌患者42 230例，死亡30 230例，死亡率在所有癌症中位居第五[1].肝癌治疗方法依然是传统的“手术、放疗、化疗”，由于缺乏靶向性药物，原发性肝癌的五年生存率依然很低，因此对肝癌细胞特异性杀伤的化合物开发显得尤为重要[2-3].植物的天然产物是发现新药物的热点研究领域之一，其中硫醚类尤其是异硫氰酸酯这一类化合物抗癌效果显著[4].这类化合物往往通过影响细胞周期，诱导细胞凋亡发挥抗癌活性.异硫氰酸酯不是由植物本身产生的，而是在细胞损伤后通过黑芥子酶(β-硫代葡萄糖苷葡萄糖水解酶)将芥子油苷进行催化反应后释放出的一类产物.迄今为止，已在芸苔属植物目及其分解产物中鉴定出大约130 种不同的芥子油苷及其催化产物[5].如图1所示，异硫氰酸酯类中的异硫氰酸异丁酯(CAS 号：591-82-2)抗癌活性较为突出，它来源于十字花科植物，挥发性强.然而关于它对肝癌细胞的杀伤效应的研究目前尚未报道.

图1 异硫氰酸异丁酯的二维结构图Fig.1 The two-dimensional structure of isobutyl isothiocyanate

巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一种广泛表达的促炎细胞因子，它的受体是CD74，MIF的互变异构酶区域在MIF-CD74 相互作用中发挥着重要作用，一些MIF抑制剂正是通过靶向互变异构酶区域，进而抑制MIF与CD74结合[6].MIF可以通过调控下游蛋白表达参与炎症与癌症进程.一些癌症干细胞通过过表达MIF下调p53，进而影响细胞周期、抑制细胞凋亡，引起免疫失调以及诱导癌症.HepG2细胞中p53为野生型，MIF能够与细胞核内的p53相互作用，启动p53的转录因子活性，激活下游的Bax与p21基因表达，调控癌细胞的增殖[6].当细胞处于应激状态下，如DNA损伤、氧化应激等，p53蛋白表达增加，影响细胞周期与细胞凋亡.在一些炎症与癌症病理状态下，除了MIF过度表达，白介素6(Interleukin-6，IL-6)/JAK/STAT信号通路也往往过度激活，因此一些小分子化合物药物通过抑制 IL-6/JAK/STAT 信号通路的激活，进而治疗该通路不正常激活引起的相关炎性疾病或癌症，例如tofacitinib(托法替尼，辉瑞制药)，ruxolitinib(芦可替尼，Novartis)，pacritinib(帕克替尼，CTI)，AZD1480(临床研究阶段)等[7-8].

本研究结合分子细胞实验方法与生物信息学技术，探索异硫氰酸异丁酯特异性抑制肝癌细胞增殖的效应，并深入阐明其作用机理，为抗肝癌靶向药物的研究提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验仪器

流式细胞仪(NovoCyte，美国Agilent)，化学发光凝胶程像系统(ChemiDoc XRS+，美国Biorad)，二氧化碳培养箱(MCO-18AC，三洋)，超净工作台(SW-CJ-1FD，苏州安泰)，倒置显微镜(IXplore，日本Olympus)，免疫印迹实验用电泳槽、转膜用电源及转膜槽购自Biorad公司.

1.2 材料与试剂

医药级异硫氰酸异丁酯购自TCI试剂公司(I0186)；HepG2、L02、7701与293T细胞购自武汉大学细胞保藏中心(CCTCC，China Center for Type Culture Collection，Wuhan，Hubei，China)，JAK2(3230S)、p-JAK2(3771)、STAT3(9139)和p-STAT3(9145S)抗体购自美国Cell Signal Technology公司；p53(ab1101)、MIF(ab187064)和β-actin(ab8226)购自Abcam；RPMI-1640培养基、DMEM培养基0.05%胰酶、青霉素链霉素溶液、胎牛血清均购于Hyclone公司；一次性细胞培养皿、培养瓶、一次性移液管等细胞培养一次性耗材均购于NEST公司；细胞凋亡检测双染法试剂盒Annxein-V-FITC检测试剂盒(C1062M)，免疫印迹实验相关化学试剂等购自碧云天.

1.3 实验方法

1.3.1 MTT实验 将对数生长期的HepG2、L02、293T与7701细胞系，以1×105个接种于96孔板中，置于5% CO2培养箱37 ℃培养24 h，待细胞贴壁后分别加入不同浓度的异硫氰酸异丁酯溶液，使其终浓度分别为0、1.563、3.125、6.25、12.5、25 μg·mL-1.根据570 nm波长下检测得到的光吸收值结果计算细胞的存活率：存活率(%)=D(570)实验组/D(570)空白组×100%，通过GraphPad软件拟合出异硫氰酸异丁酯对各细胞的半数抑制浓度(50% inhibiting concentration，IC50).

1.3.2 细胞迁移检测实验 划痕实验用于检测化合物对HepG2迁移的影响，将HepG2以2×106个接种于6孔板中，置于5% CO2培养箱37 ℃培养24 h，待细胞贴壁后进行划线，并且分别加入不同浓度的异硫氰酸异丁酯溶液，使其终浓度分别为0、0.875、1.75 μg·mL-1.5% CO2培养箱37 ℃培养24 h与48 h后通过显微镜进行局部观察和拍照，用Image J处理图片，对划痕面积进行统计分析，S代表划痕面积，计算细胞迁移率：细胞迁移率(%)=(S0-St)/S0×100%.

1.3.3 生物信息学分析 SEA (similarity ensemble approach，http：//sea.bkslab.org/)数据库整合了ChEMBL和MDDR等数据库的化合物和靶标信息，利用Daylight分子指纹计算化合物的相似性，并将相似化合物的靶标进行聚类[9].通过化合物的SMILES结构式与数据库进行匹配，得到化合物的潜在靶标为MIF，接着将MIF做进一步的分子对接分析，将异硫氰酸异丁酯与MIF蛋白的天然配体分别对接到蛋白结合口袋中，结合自由能打分进行分析.

1.3.4 流式细胞检测 流式细胞技术用于检测药物对HepG2细胞凋亡的影响，将HepG2以2×106个接种于6孔板中，置于5% CO2培养箱37 ℃培养24 h，待细胞贴壁后分别加入不同浓度的异硫氰酸异丁酯溶液，使其终浓度分别为0、0.435、0.875、1.75 μg·mL-1.通过Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide，PI)对细胞进行染色，通过流式细胞仪检测处于不同阶段的细胞所占的比例.

1.3.5 免疫印迹检测 将HepG2细胞以2×106个接种到6孔板中，待细胞贴壁后向每个孔分别加入不同浓度的异硫氰酸异丁酯溶液，使其终浓度分别为0、0.435、0.875、1.75 μg·mL-1.将细胞置于37 ℃ CO2培养箱中培养24 h，收集并处理细胞，提取蛋白，进行蛋白定量，通过免疫印迹实验检测JAK/STAT3信号通路蛋白，p53蛋白以及内参蛋白β-actin表达情况.不同细胞系蛋白检测MIF和内参蛋白β-actin表达情况.具体步骤参见参考文献[10-11].

1.3.6 统计分析 利用Excel与GraphPad软件进行统计分析与作图，t检验分析检测实验结果差异显著性，以*表示p<0.1，**表示p<0.05，***表示p<0.01，NS表示没有显著性差异.

2 实验结果

2.1 异硫氰酸异丁酯显著抑制HepG2细胞增殖

如图2所示，MTT检测显示异硫氰酸异丁酯对HepG2和L02细胞生长抑制效应较为显著，通过数据分析表明化合物对HepG2和L02两种细胞的IC50分别为3.5与13.0 μg·mL-1，其生长抑制曲线如图2中的a和b所示.而对293T与7701两种细胞在最大浓度25 μg·mL-1时生长抑制效应也不显著.实验表明异硫氰酸异丁酯对肝癌细胞HepG2的生长抑制效应最显著.

a.不同浓度异硫氰酸异丁酯作用24 h后HepG2细胞的存活率； b.不同浓度异硫氰酸异丁酯作用24 h后L02细胞的存活率； c.不同浓度异硫氰酸异丁酯作用24 h后293T细胞的存活率； d.不同浓度异硫氰酸异丁酯作用24 h后7701细胞的存活率图2 异硫氰酸异丁酯显著抑制HepG2细胞的增殖Fig.2 Isobutyl isothiocyanate inhibits the proliferation of HepG2 cells significantly

2.2 异硫氰酸异丁酯诱导HepG2细胞凋亡

为了进一步探究异硫氰酸异丁酯对HepG2细胞显著性抑制的机理，进一步通过流式细胞技术检测化合物对细胞凋亡的影响.细胞凋亡检测的数据图像分为四个象限，左下角为正常存活的细胞，右下角为早期凋亡细胞，右上角为晚期凋亡细胞，左上角为坏死的细胞.根据流式细胞仪检测结果如图3所示：浓度为0、0.437、0.875、1.75 μg·mL-1的异硫氰酸异丁酯处理后的正常存活的细胞比率分别为99.68%、72.82%、68.92%和54.46%，而晚期凋亡细胞的比率分别为0.05%、22.65%、24.40%和37.68%，即异硫氰酸异丁酯的浓度越高，正常存活的细胞比率越低，而晚期凋亡的细胞比率越高.这表明异硫氰酸异丁酯对HepG2细胞能够诱导细胞凋亡，并且随着异硫氰酸异丁酯浓度的增加，促进细胞凋亡效应越显著，即存在剂量依赖效应.

2.3 异硫氰酸异丁酯抑制HepG2细胞迁移

为了进一步探究HepG2细胞对异硫氰酸异丁酯显著敏感性的机理，通过划痕实验检测该化合物是否影响HepG2的迁移.划痕宽度变窄是由细胞迁移导致，实验组中在加入了不同浓度的异硫氰酸异丁酯以及共孵育后通过显微镜拍照与统计分析，结果如图4所示，异硫氰酸异丁酯对细胞迁移的影响效果显著.对比各个浓度下的划痕宽度发现，如图4a与4b所示，HepG2细胞在异硫氰酸酯浓度为0 μg·mL-1时，24 h与48 h后划痕宽度与0 h相比减小十分显著，细胞迁移率分别为61.76±8.33%和78.07±7.57%；细胞在化合物浓度为0.875 μg·mL-1时，24 h与48 h后划痕宽度与0 h相比有一定减小，细胞迁移率分别为12.02±3.65%和58.90±10.28%；细胞在化合物浓度为1.75 μg·mL-1时，24 h与48 h后划痕宽度与0 h相比变化不明显，细胞迁移率分别为2.78±2.56%和15.79±6.58%.实验结果表明异硫氰酸异丁酯抑制HepG2细胞迁移，且存在剂量依赖效应.

a.0 μg·mL-1异硫氰酸异丁酯处理后的正常存活细胞与晚期凋亡细胞比率分别为99.68%与0.05%； b.0.437 μg·mL-1异硫氰酸异丁酯处理后的正常存活细胞与晚期凋亡细胞比率分别为72.82%与22.65%； c.0.875 μg·mL-1异硫氰酸异丁酯处理后的正常存活细胞与晚期凋亡细胞比率分别为68.92%与24.40%； d.1.75 μg·mL-1异硫氰酸异丁酯处理后的正常存活细胞与晚期凋亡细胞比率分别为54.46%与37.68%图3 异硫氰酸异丁酯诱导HepG2细胞凋亡Fig.3 Isobutyl isothiocyanate induced the apoptosis of HepG2 cells

a.不同浓度异硫氰酸异丁酯作用下HepG2细胞0 h、24 h与48 h的划痕图片；b.0、0.875与1.75 μg·mL-1异硫氰酸异丁酯作用24 h与48 h时HepG2的细胞迁移率；标尺长度为200 μm图4 异硫氰酸异丁酯抑制HepG2细胞的迁移Fig.4 Isobutyl isothiocyanate inhibits HepG2 cell migration

2.4 异硫氰酸异丁酯通过靶向MIF蛋白发挥作用

为了从分子水平探究异硫氰酸异丁酯抑制HepG2细胞增殖，诱导细胞凋亡的机理，本实验利用生物信息学技术分析该化合物的潜在靶标.SEA 数据库分析结果表明MIF为异硫氰酸异丁酯的潜在靶标，如图5a所示异硫氰酸异丁酯上的N原子可以和MIF的64号位异亮氨酸形成氢键，化合物尾部的甲基可以和MIF产生疏水相互作用.接着将MIF做进一步的分子对接分析，将异硫氰酸异丁酯与MIF蛋白的天然配体分别对接到蛋白结合口袋中，结合自由能打分显示异硫氰酸异丁酯为-3.9，和天然配体的打分-4.2较为接近.结果表明异硫氰酸异丁酯和MIF晶体结构中的天然配体结合位置和模式接近(图5b)，即MIF的天然配体和异硫氰酸异丁酯有类似的结合模式，进一步说明MIF可能是异硫氰酸异丁酯的潜在靶标，异硫氰酸异丁酯可能对MIF产生一定的生物活性，异硫氰酸异丁酯和MIF结合口袋相互作用模式如图5b所示.为了探究HepG2、L02、293T和7701四株细胞对异硫氰酸异丁酯不同敏感性是否与细胞MIF表达水平有关，进一步通过免疫印迹实验检测不同细胞株中MIF表达量，结果如图5c所示，HepG2细胞中MIF表达量最高，293T和7701细胞中MIF表达量低于HepG2和L02.

a.异硫氰酸异丁酯和MIF结合口袋相互作用模式图； b.异硫氰酸异丁酯(绿色)和天然配体(红色)结合模式对比图； c.HepG2、L02、293T和7701细胞中MIF蛋白表达量图5 异硫氰酸异丁酯生物信息学分析结果Fig.5 Results of bioinformatics analysis of isobutyl isothiocyanate

2.5 异硫氰酸异丁酯抑制HepG2细胞JAK2/STAT3信号通路的激活

为进一步探究异硫氰酸异丁酯是否影响MIF以及下游的p53表达量，将0、0.437、0.875与1.75 μg·mL-1异硫氰酸异丁酯与HepG2细胞共孵育24 h后，收集细胞提取蛋白，通过免疫印迹法进行检测，结果如图6所示.不同浓度化合物作用下MIF蛋白表达量没有差异，然而0.875与1.75 μg·mL-1浓度下p53蛋白表达量显著降低，这表明异硫氰酸异丁酯抑制p53表达.进一步检测JAK2/STAT3通路的激活情况发现，0、0.437、0.875与1.75 μg·mL-1异硫氰酸异丁酯与HepG2细胞共孵育24 h后，不影响JAK2 与STAT3的蛋白表达水平，但是能显著性的抑制JAK2 与STAT3的磷酸化，且随着化合物浓度增加，抑制磷酸化水平的效应更显著，这表明化合物能抑制JAK/STAT3信号通路的激活，且具有剂量依赖效应.

图6 异硫氰酸异丁酯抑制HepG2细胞 JAK2/STAT3信号通路的激活Fig.6 Isobutyl isothiocyanate inhibited the activation of JAK2/STAT3 signaling pathway in HepG2 cells

3 讨论

本研究通过分子生物学与生物信息学方法首次发现异硫氰酸异丁酯能抑制原发性肝癌细胞HepG2生长(IC50分别为3.5 μg·mL-1)，当浓度≥0.437 μg·mL-1时化合物诱导细胞凋亡，当浓度≥0.865 μg·mL-1化合物抑制细胞迁移.其分子机理可能分为两个方面：首先该化合物能够显著下调JAK2和STAT3蛋白的磷酸化，进而抑制JAK2/STAT3信号通路的激活，从而下调STAT3调控的蛋白，抑制细胞的增殖.另一方面，由于异硫氰酸异丁酯不影响HepG2细胞MIF表达水平，但是显著抑制p53表达量，这表明化合物可能不通过调控MIF表达，而是干扰MIF蛋白与其受体CD74相互作用，进而抑制下游的p53表达量与功能，阻滞细胞周期的正常进行，诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖[12-13].

目前关于异硫氰酸酯类化合物的抗癌活性研究中，关于异硫氰酸烯丙酯(allyl isothiocyanate，AITC)抗癌机理的研究最为深入.高剂量(>20 μM)的异硫氰酸烯丙酯能抑制HepG2细胞的增殖与迁移，并造成DNA损伤，而低剂量的化合物(1.25～2.5 μmol·L-1)效果相反，其分子机理为异硫氰酸烯丙酯通过造成DNA损伤，阻滞细胞周期引起细胞凋亡等方式，对肺癌细胞、乳腺癌细胞、白血病细胞等造成杀伤作用[14].其靶蛋白包括DNA拓扑异构酶、p53蛋白与微管蛋白.除了异硫氰酸烯丙酯以外，4-(α-L-吡喃鼠李糖氧基)苄基葡糖苷异硫氰酸酯也能够激活p53和Bax，抑制 Bcl-2 蛋白进而诱导恶性星形细胞瘤细胞的细胞凋亡[13].本研究与上述实验结果一致，异硫氰酸异丁酯可能通过影响MIF与受体相互作用，进而调控p53，促进癌细胞凋亡.

综上所述，本文研究表明原发性肝细胞癌细胞系HepG2对异硫氰酸异丁酯的敏感性高于肝正常细胞系L02，远高于肝正常细胞系7701以及人胚肾上皮细胞系293T，即异硫氰酸异丁酯可能具有特异性的对原发性肝细胞癌抑癌潜能.这可能是由于HepG2细胞中MIF表达量高于不敏感细胞株，因此对异硫氰酸异丁酯更为敏感，化合物作用于靶蛋白MIF后，能更有效的调控细胞周期与细胞凋亡相关级联反应，进而阻滞细胞周期的正常进行，诱导细胞凋亡[15-17].另外，异硫氰酸异丁酯也可能靶向HepG2细胞DNA复制与修复相关酶，进而造成DNA损伤，阻滞细胞进入正常的细胞周期，而DNA损伤的细胞范围与细胞谱系密切相关，造成HepG2细胞对该化合物更为敏感[18-19].后续还需要更深入研究异硫氰酸异丁酯抗肝癌的其他分子机制，以及检测该化合物是否对其他癌细胞也具有生长抑制效应.