开口箭均一多糖 TCP-C1-1的结构分析及其生物活性

李文聪，李雪妍，柯银铅，祝梓旋，刘呈雄，郭志勇，刘朝霞，邹 坤

(三峡大学湖北省天然产物研究与利用重点实验室，湖北 宜昌 443003)

开口箭，又名粗丝，其基源植物为百合科铃兰属TupistrachinensisBaker.开口箭植物主要分布于我国四川、云南、浙江等地.开口箭是一种少数民族民间用药[1]，主要治疗于咽喉肿痛，白喉，胃痛等，并在《中药大辞典》《全国中药汇编》等药学文献中均有收录.现代药理研究发现，开口箭具有细胞毒、抗炎、抗菌、抗肿瘤等药理活性[2-6].但是目前对开口箭多糖部位的研究尚不多见.

赵烨等[7]通过实验表明开口箭粗多糖对金黄色葡萄球菌、大肠希维尔菌具有较好的抑制作用.解燕等[8]通过对开口箭水提物研究发现其具有一定的免疫活性，并且在后续的实验中，从DEAE-52阴离子树脂分离得到的开口箭粗多糖可以显著增强正常小鼠的细胞活力，并且能显著抑制S180实体肿瘤细胞的生长.本课题前期对开口箭的粗多糖进行免疫抗肿瘤活性的初步研究，其具有较好的药理活性.但开口箭多糖的纯化和结构分析，及多糖与其活性关系，尚无深入研究，本研究从此入手，从开口箭根茎部分离提取纯化得到多糖，并探究其生物学活性.

1 材料与仪器

1.1 材料

D-甘露糖(麦克林)、L-鼠李糖(麦克林)、D-无水葡萄糖(麦克林)、D-半乳糖(麦克林)、D-果糖(麦克里面)、葡聚糖标准品T1000、T2000、T6000、T10000、T20000(麦克林)、VC(国药集团)、DEAE-52 阴离子树脂(科密欧)、SephadexG-200 凝胶(科密欧)、硅胶薄层板(科密欧)、其他试剂均为分析纯级别.

开口箭，采摘自湖北省宜昌市长阳土家族自治县， 经三峡大学化学与生命科学学院陈发菊副教授鉴定为TupistrachinensisBaker.

1.2 仪器

紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)、CBM-10A vp Plusl液相(岛津)、Ulitimate 3000高效液相(Thermo)、外接示差显示器(Shodex)、红外光谱仪(AoelAB)、核磁共振仪(Bruker AVANCE 500 MHz)、酶标仪(TECAN).

2 方法

2.1 开口箭的提取和分级醇沉

开口箭根部50 kg，洗净切碎，在65 ℃以 95%乙醇浸提 3次脱脂后，在残渣中加入蒸馏水，于微沸状态下进行提取，浓缩干燥蒸馏得开口箭粗多糖.称量开口箭粗多糖样品102.3 g，加入1 500 mL纯水，超声加热溶解，再分别以30%、60%、80% 不同的乙醇浓度进行分级醇沉，采用2 500 r·min-1离心机进行离心15 min，收集离心管下层中的沉淀，干燥称重，得到了多糖A、B、C，并将其命名为TCP-A、TCP-B、TCP-C，计算得率，其得率计算公式为m醇沉部位/m粗样品×100%.

2.2 醇沉部位的总糖含量测定

总糖含量测定是基于赖长江生等[9]使用苯酚-浓硫酸显色的方法，略有调整.

葡萄糖标准溶液的配制：称取0.102 7 g，于 105 ℃干燥至恒重的葡萄糖标准品，加蒸馏水定容至 100 mL.取 5 mL，再用蒸馏水定容至50 mL，配置成0.1 mg·mL-1标准储备液.

样品溶液的配制：称取开口箭粗多糖，TCP-A、TCP-B、TCP-C各100 mg，分别加蒸馏水定容至100 mL.取5 mL，再用蒸馏水定容至50 mL，配置成0.1 mg·mL-1样品储备液.

葡萄糖标准曲线的制作：移取上述葡糖糖标准液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 放置于 25 mL的具塞试管中，加蒸馏水至1 mL，再分别加入1 mL的苯酚和5 mL的浓硫酸.充分振摇，将其置于80 ℃水浴锅中水浴30 min，另取蒸馏水做空白对照，于485 nm下测定样品的吸光，对照品葡萄糖质量浓度为横坐标，D(485)值为纵坐标绘制标准曲线.

通过标准曲线法可以计算样品中总糖量m总糖，按照公式m总糖/m样品×100%计算样品中的糖含量.

2.3 对粗多糖C脱蛋白前后蛋白含量的测定

称取TCP-C 20 g以适量的纯水溶解，加入 1∶1(V/V)的 Sevage 试剂即正丁醇∶氯仿=1∶4(V/V) ，搅拌，分液，重复6次.

蛋白含量测定是基于Bohle等[10]方法，在本实验室具体试剂情况对其条件进行调整.

考马斯亮蓝溶液配置：称取考马斯亮蓝 G250 10 mg放置烧杯中，加入5 mL 浓度为95%的乙醇，加入后搅拌，待到固体全部溶解，加入50 mL浓度为85%的磷酸，边加入边搅拌，待颜色变成均一的红棕色，加入100 mL纯水.

蛋白标准品配置：称取牛血清蛋白标准品50 mg，放入10 mL的容量瓶中，定容，配制成5 mg·mL-1的标准储备液.

样品溶液配置：称取未除蛋白粗TCP-C和已除蛋白的TCP-C 各50 mg，加入10 mL纯水溶解，配置5 mg·mL-1的样品待测液.

蛋白含量标准曲线的制作：移取上述蛋白标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 放置于25 mL的具塞试管中，加入0.15 moL·L-1NaCl溶液至5 mL，再加入5 mL上述考马斯亮蓝试剂，充分震摇，另取蒸馏水做空白对照，于595 nm下测定样品的吸光值D(595)，绘制标准曲线.

样品中蛋白含量测定：移取上述的样品溶液各吸取5 mL放置于25 mL的具塞试管中，再加入5 mL上述考马斯亮蓝试剂，充分震摇，另取蒸馏水做空白对照，使用标准曲线法测定样品中蛋白质量m蛋白.

通过标准曲线法可以计算样品中蛋白m蛋白，按照公式m蛋白/m样品×100%计算样品中的蛋白含量.

2.4 DEAE-52 纤维素离子交换树脂纯化

将上述去蛋白后的TCP-C，加入已经预处理的 DEAE-52 离子交换树脂柱层析，流动相体系为纯水，0.1 mol·L-1NaCl溶液、0.3 mol·L-1NaCl溶液、0.7 moL·L-1NaCl溶液.每10 mL收集1次，按2.2方法测量其吸光度.收集各个部分，将其命名为TCP-C1、TCP-C2、TCP-C3、TCP-C4.

2.5 葡聚糖凝胶Sephadex G200纯化和纯度验证

将纯水部位TCP-C使用Sephadex G200进行纯化分离，收集主峰得到 TCP-C1-1，后再采用葡聚糖凝胶Sephadex G-200 进行纯化和检验，每10 mL收集1次，具体检测方法采用苯酚-浓硫酸法检测，方法同2.2收集主峰.

2.6 TCP-C1-1多糖相对分子质量测定

该部分实验是基于王国佳等[11]使用葡聚糖凝胶测量多糖相对分子质量的方法，并且根据本实验对其条件进行优化调整.

标准品溶液配置：分别称取已知相对分子质量1 000、2 000、6 000、10 000、20 000 的多糖标准品15 mg，定容至5 mL.

样品溶液配置：取得到的均一多糖 TCP-C1-1 15 mg，定容至 5 mL.

流动相：100% 纯水35 min柱温：35 ℃，进样量：15 μL.

样品采用和标准同样的色谱条件，具体为纯水相.

2.7 TCP-C1-1多糖红外光谱(IR)分析

称取干燥的 TCP-C1-1 样品5 mg，使用红外光谱仪进行测定.

2.8 TCP-C1-1多糖单糖构成

该部分实验是基于陈凌霄等[12]对于TLC薄层色谱确定多糖的单糖构成方法的探索，并依据本实验室实际情况进行方法调整.

2.8.1 溶液配置 标准品溶液配置：分别称取果糖90 mg，葡萄糖 90 mg，甘露糖 90 mg，半乳糖 90 mg，鼠李糖 90 mg，分别加入 2 mL纯水，振荡，加热，使其完全溶解后备用.

显色剂溶液配置：称取2 g的苯胺，量取2 mL的二苯胺，量取100 mL丙酮溶液，将苯胺和二苯胺加入其中，振荡溶解.

展开剂溶液配置：展开剂体系以正丁醇：异丙醇∶水∶醋酸=7∶5∶2∶1的体积比进行配置，即量取正丁醇1.4 mL，异丙醇1.0 mL，水0.4 mL，醋酸0.2 mL进行混合待用.

2.8.2 TCP-C1-1多糖水解 称取TCP-C1-1 50 mg，加入2 mL的水进行溶解，再加入4 mL 2 mol·mL-1的三氟乙酸溶液，密封后置于烘箱中于110 ℃水解4 h，取出后待其冷却至室温，使用旋转蒸发仪蒸干，后加入甲醇洗涤，继续使用旋转蒸发将其蒸干，反复多次，直至水解样品无酸味.取出样品，使用0.5 mL水溶解，待用.

2.8.3 TLC薄层色谱分析 将上述标准品和多糖水解液，进行点板操作，使用吹风机将残存溶液吹干，将苯胺-二苯胺丙酮溶液使用喷雾器喷洒其中，将其置于烘箱中90 ℃，加热1 h.

2.9 TCP-C1-1核磁共振分析

称取冻干的TCP-C1-1 样品40 mg，使用D2O进行溶解，在其中加入两滴氘代丙酮，使用核磁进行测定.

2.10 TCP-C1-1生物活性研究

2.10.1 DPPH清除活性研究 DPPH溶液配置：称取5 mg DPPH，加入到无水乙醇定容到100 mL，充分溶解，避光.

阳性对照VC梯度浓度的配置：准确称取100 mg VC定容至100 mL，分别配置成0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·mL-1的梯度水溶液.

样品梯度浓度的配置：称取样品 TCP-C1-1 20 mg定容至10 mL，分别配置成0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·mL-1的梯度水溶液.

DPPH自由基清除率的的测定：取2 mL 样品或VC水溶液于试管中，加入2 mL DPPH 溶液，空白组为2 mL 样品+2 mL 无水乙醇，对照组为2 mL DPPH+2 mL ddH2O，混匀后避光反应 2 h，517 nm 处测吸光值.

DPPH自由基清除率= [1-(D样品-D空白)/D对照] × 100%.

2.10.2 TCP-C1-1对α-糖苷酶抑制活性 配置0.1 moL·L-1pH=6.8缓冲溶液：取0.790 g KH2PO4和1.792 1 g Na2HPO4·12H2O，溶于100 mL的纯水中.

酶溶液配置：将母液100 U溶于1 mL上述配置的缓冲溶液中.

底物4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)溶液配置：称取PNPG 15.6 mg使用上述配置的缓冲液，溶解于5 mL上述配置的缓冲溶液中.

阿卡波糖溶液配置：称取6.5 mg的阿卡波糖，使用上述配置的缓冲溶液1 mL溶解.并且将母液两倍稀释 为6、3、1.5、0.75、0.375、0.187 56 mg·mL-1.

碳酸钠溶液配置：称取0.212 g的碳酸钠，使用纯水定容至10 mL，得到0.2 moL·L-1的碳酸钠溶液、

TCP-C1-1样品溶液配置：称取TCP-C1-1样品6.5 mg，用容量瓶定容到1 mL，配置成10 mg·mL-1的母液，并且将母液稀释为0.20、0.41、0.81、1.63、3.25、6.50 mg·mL-1.

操作方法：使用移液枪量取40 μL上述配置的酶溶液加入到96孔板上，再加入不同浓度的抑制液80 μL，并且37 ℃水浴锅中加热10 min，取出后加入40 μL的底物，并再置于37 ℃水浴锅30 min，使用微孔震荡板500 r·min-1震荡2 min取出后加入100 μL的碳酸钠溶液终止反应，使用酶标仪在405 nm下测量吸光度.

背景组：上述同样的操作，不加酶溶液，不加入样品，加入120 μL缓冲液.

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空白组：上述同样的操作，加入酶溶液，不加入样品，加入80 μL缓冲液.

抑制率=[D空白-(D样品-D背景)]/D空白×100%.

2.10.3 TCP-C1-1对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的抗炎活性的影响

1) 小鼠单核巨噬细胞 RAW264.7 的增殖实验.将指数生长期的小鼠单核巨噬细胞 RAW 264.7 以 1×105个/孔的密度接种在 96 孔板中.加入不同 质量浓度(0.1857、0.375、0.75、1.5、3 μg·mL-1)TCP-C1-1，每个样品质量浓度设置3个平行组，通过酶标仪492 nm的波长下测量每一组的D(492)值，以细胞培养液处理细胞作为对照组，按照公式计算细胞活力.

细胞活力=D实验/D对照.

2) TCP-C1-1 对RAW 264.7细胞释放NO的影响.Grisse 法检测 NO 的水平将小鼠单核巨噬细胞 RAW 264.7(2.5×105个/孔)接种到 24 孔板中，用脂多糖(LPS)1 μg·mL-1处理 2 h 后，加入不同质量浓度的TCP-C1-1.24 h 后，收集培养上清液.每个样品质量浓度(0.375、0.75、1.5 μg·mL-1)设置 3 个平行组，同时以细胞培养液处理细胞作为对照组.根据试剂盒说明书操作，用酶标仪测量每组的D(492)值.根据D(492)值，测定得到的标准曲线计算细胞培养上清液中NO的水平.

3) 统计学分析.SPSS 19.0软件分析实验数据，单因素方差分析用于比较多组间差异，Dunnett-t检验用于两组间均数差异的比较：p<0.05则差异具有统计意义.

3 结果与分析

3.1 分级醇沉

多糖A、B、C的质量及其得率见表1.

表1 分级醇沉各个部分糖质量Tab.1 Mass of each part of graded alcohol precipitation

3.2 不同醇沉部位的总糖含量

图1 总糖含量标准曲线Fig.1 standard curve of total sugar content

表2 各个部分多糖含量

3.3 对粗多糖C脱蛋白前后蛋白含量的测定

蛋白质含量的标准曲线见图2，线性回归方程y=0.6222x-0.3819，R2=0.9964.计算出未除蛋白的TCP-C的蛋白含量为16.2%，已除蛋白的TCP-C的蛋白含量为1.9%，表明该部分蛋白已经去除的较为完全.

图2 蛋白含量测定标准曲线Fig.2 Standard curve of protein content determination

3.4 DEAE离子交换树脂的洗脱曲线

DEAE离子交换树脂洗脱曲线与洗脱组分如图3与表3所示，其中纯水部分(0～20瓶)出峰形较为对称，收集该部分，并将其命名为TCP-C1.

3.5 均一多糖的纯度验证

通过葡聚糖凝胶纯化Sephadex G-200 对TCP-C1多糖进行分离，得到均一多糖TCP-C1-1，并对其纯度进行验证(图4)，采用葡聚糖凝胶验证，通过洗脱曲线可以判断，其峰形较为对称.可以判断TCP-C1-1是均一多糖.

图3 多糖C的DEAE洗脱曲线Fig.3 DEAE elution curve of TCP-C

表3 DEAE洗脱各部组分

3.6 TCP-C1-1的相对分子质量测定

如图5所示，不同相对分子质量的葡萄糖标准品的线性回归方程为y=-8275.5x+167926，R2=0.9902.TCP-C1-1其高效凝胶色谱液相图如图6所示，从液相图的出峰也可以判断TCP-C1-1是均一多糖，TCP-C1-1出峰时间在18.5 min.通过计算可以得出，该均一多糖相对分子质量为1.52×104.

图4 TCP-C1-1均一多糖Sephaedx G-200验证洗脱曲线Fig.4 TCP-C1-1 validation elution curve of Sephaedx G-200 homogeneous polysaccharide

图5 多糖相对分子质量测定标准曲线Fig.5 Standard curve of polysaccharide molecular weight determination

图6 TCP-C1-1出峰时间Fig.6 TCP-C1-1 departure time

3.7 红外光谱测定

TCP-C1-1红外光谱如图7所示，3 286 cm-1为羟基的伸缩震动，此为多糖的特征吸收峰，2 941 cm-1为糖上几个中弱峰的C-H震动，1 022 cm-1为 C-O 伸缩振动峰；923 cm-1弱峰为端基碳 C-H 弯曲振动峰；903 cm-1处有吸收说明该糖组分中含有 β-糖苷键.

3.8 均一多糖TCP-C1-1 的单糖构成

果糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖和水解后的TCP-C1-1如图8所示，通过图8可以判断，水解后的TCP-C1-1和果糖的位置极为相近，所以可以判断，该TCP-C1-1可能是由果糖组成的一种果聚糖.

图7 TCP-C1-1红外吸收Fig.7 TCP-C1-1 infrared absorption

图8 标准品和TCP-C1-1酸解单糖对比Fig.8 Comparison between standard and TCP-C1-1 acidolysis monosaccharide

3.9 TCP-C1-1核磁共振分析结果

通过微谱数据库比对，发现TCP-C1-1中碳谱的化学位移值与Li等[13]实验过程中发现的果聚糖碳谱的化学位移值高度重合，其结果如表4所示，其文献中报道的结构如图9所示.

表4 TCP-C1-1碳谱数据和β-(2→1)果聚糖碳谱数据Tab.4 13C NMR results of TCP-C1-1 and β-(2→1) fructan

图9 文献中所报道β-(2→1)果聚糖结构图Fig.9 β-(2→1) fructan structure diagram reported in the literature

果聚糖是由一分子由果糖和葡萄糖的二糖蔗糖和一个或者多个果糖形成的.Li等[13]在文献中介绍了葡萄糖残基鉴定方法，其主要采用核磁共振氢谱来进行判断，首先氢谱上δ=5.31位置的葡萄糖残基上的1号氢和果糖残基上的4号氢进行积分相对比，从而确定葡萄糖残基存在.

TCP-C1-1的核磁共振氢谱如图10所示，在对δ=5.31 和葡萄糖残基上的1号氢和δ=4.12、δ=4.14果糖残基上的4号氢进行积分，结果确定其存在约为83倍关系，本实验使用葡聚糖凝胶测定TCP-C1-1相对分子质量为15 200，以83倍的关系可以推算其相对分子质量为15 120，这符合于TCP-C1-1的相对分子质量测定，所以可以证明TCP-C1-1中含有一分子葡萄糖残基.

图10 TCP-C1-1核磁共振氢谱Fig.10 TCP-C1-1 nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum

综上所述，可以确定TCP-C1-1是由果糖组成的果聚糖，且存在β糖苷键，其相对分子质量为15 200，连接方式为(2→1)连接，其结构如图11所示，是一类菊粉果聚糖.

图11 TCP-C1-1结构Fig.11 TCP-C1-1 structure

3.10 TCP-C1-1生物活性研究

3.10.1 DPPH清除活性研究 TCP-C1-1多糖样品DPPH自由基清除活性如图12所示，TCP-C1-1多糖具有一定的 DPPH 自由基清除活性，在一定浓度范围，随着多糖浓度升高，活性增强.在浓度为2 mg·mL-1时，其清除率可以达到可以达到63.3%.

图12 VC和TCP-C1-1对DPPH自由基的清除活性Fig.12 DPPH free radical scavenging by VC and TCP-C1-1

3.10.2 TCP-C1-1对α-糖苷酶的抑制活性 TCP-C1-1对α-糖苷酶抑制活性如图13所示，通过 TCP-C1-1和阿卡波糖的对比，在保持浓度相近的情况下，TCP-C1-1其对糖苷酶的抑制活性表现优越，远高于阳性对照药阿卡波糖，并且在浓度为6.50 mg·mL-1时，其抑制活性可以达到74.4%.

3.10.3 TCP-C1-1细胞抗炎活性 由图14可知，TCP-C1-1对小鼠的巨噬细胞RAW 264.7作用24 h后，于对照比相比，TCP-C1-1其在0.187 5、0.375、0.75、1.5、3、6 μg·mL-1下，都能显著促进其细胞的增长.在低浓度时，其促进细胞增殖活动于浓度呈现线性关系，于对照组相比较，具有显著的差异，其中在1.5 μg·mL-1促进细胞增长最明显.

图13 阿卡波糖和TCP-C1-1 对α-糖苷酶抑制活性Fig.13 α-GLycosidase inhibitory activity of acarbose and TCP-C1-1

如图15所示，于LPS对照组相比，TCP-C1-1的浓度达到1.5 μg·mL-1的情况下时，其可以显著抑制细胞产生NO.并且明显低于对照组.证明TCP-C1-1可以显著抑制由LPS诱导出的炎症损伤，且成一定剂量依赖的关系.

图15 TCP-C1-1 对LPS诱导RAW 264.7 细胞释放NO的影响Fig.15 Effect of TCP-C1-1 on the release of NO from RAW264.7 cell

4 结果

本实验从开口箭根部分离提取得到均一多糖，其相对分子质量为1.52×104，TCP-C1-1是由果糖均一多糖构成的，其为β-(2→1)连接.通过后续对其生物活性进行实验，其在清除自由基能力抗α-糖苷酶活性方面都表现出较好的活性.在细胞抗炎活性实验方面，当细胞产生炎症时，机体中促炎症因子在内毒素的作用产生的产物NO，TCP-C1-1可抑制LPS诱导出RAW 264.7小鼠巨噬细胞炎症因子NO的产生，并且在其浓度为1.5 μg·mL-1时其明显的抑制了NO的产生，证明TCP-C1-1是一种具有较好抗炎活性的均一多糖.

对于TCP-C1-1结构和其生物活性的探讨，对于深入研究开口箭活性物质具有较为重要的意义.对中药均一多糖结构的研究，可为以多糖为主要成分的中药质量控制水平的提升奠定基础.