芒果中SOD提取工艺的优化

范 哲，顾广源

(鲁南技师学院， 山东 临沂 276000)

1 引言

芒果呈不规则的椭圆状，果肉肥厚，有核，口感细腻清甜，有“热带水果之王”的称号[1，2]。芒果中含有大量的糖类、维生素、矿物质、多种酶[3，4]等，其中超氧化物歧化酶含量较为丰富，是生物体内重要的抗氧化酶[5～7]。SOD是一种特殊的酶[8～11]，广泛存在于多种生物体内，具有清除机体超氧阴离子、调节机体代谢[12，13]的作用。

目前，芒果的研究主要集中在育种、简单粗加工，少有文献报道其抗氧化性。鉴于此，本文通过实验探究SOD提取的最适条件[14～16]。采用单因素实验，通过设置提取溶剂、料液比、浸提时间、超声功率及时间5个单因素[17～19]，得到最优值后利用正交实验获得最佳提取工艺[20，21]，为芒果的开发利用提供方向。

2 材料与方法

2.1 实验材料与仪器

2.1.1 仪器

KQ-A100DE型数控超声波清洗器，KHB-ST360型自动多功能酶标仪，DWF-100型电动植物粉碎机，冰箱、离心机、分析天平、离心管、锥形瓶、移液枪等。

2.1.2 材料及试剂

芒果、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、丙酮、SOD检测试剂盒(雷根生物)等。

2.1.3 PBS试剂的配制

母液：试剂一：0.05 mol/L Na2HPO4·12H2O ,试剂二：0.05 mol/L NaH2PO4·2H2O (表1)。

表1 不同pH值PBS的配制 mL

2.1.4 SOD试剂盒(NBT核黄素微板法)

NBT工作液的制备及SOD试剂盒加样表见表2、表3。

表2 NBT工作液的制备 μL

表3 SOD试剂盒加样 μL

2.2 实验方法

2.2.1 材料处理

取市售芒果洗净削皮去核，果肉在粉碎机打碎，经多次纱布过滤至无纤维等肉眼可见杂质，滤纸进行过滤。滤液至离心管，离心去除杂蛋白和沉淀，得上清液。

2.2.2 SOD的分离提取及纯化

2.2.2.1 提取溶剂pH值的筛选

取上清液5 mL于试管中，加入等体积的提取溶剂，0.5 h的时间浸提，提取溶剂为以下 6 种：pH=7.0、pH=7.2、pH=7.4、pH=7.6、pH=7.8、pH=8.0的0.05 mol/L PBS缓冲液。浸提0.5 min后，离心取上清液。加入等体积的预冷丙酮4 ℃条件下冷藏过夜，有白色絮状物质和胶状物质析出，过滤去除杂质。离心取上清液，得粗酶液。

2.2.2.2 溶剂的料液比

取上清液5 mL于试管中，以pH为7.2的0.05 mol/L的PBS作为提取溶剂,料液比分别为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7。浸提0.5 h后,离心除去沉淀。取上清液于试管中，预冷丙酮4℃低温过夜,离心取上清液。

2.2.2.3 提取时间的筛选

取上清滤液3 mL于试管中，以1∶5的比例加入0.05 mol/L PBS缓冲液浸提：分别浸提0.5 h、1 h、 1.5 h、2 h、2.5 h。

2.2.2.4 超声功率筛选方法

取上清滤液5 mL于多个试管中，分别加入0.05 mol/L PBS缓冲液进行超声。分别在400 W、500 W、600 W、700 W、800 W、900 W、1000 W的条件下超声10 min。对7组待测样离心除渣，取上清液，加入等体积预冷的丙酮，混合后放在冰箱4 ℃的条件下低温过夜。过滤再进行离心,取上清液。

2.2.2.5 超声时间的筛选方法

取上清滤液5 mL于多个试管中，分别加入0.05 mol/L PBS缓冲液后超声。超声功率900 W，超声时间10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min、50 min、60 min。

2.2.3 SOD的鉴定

将SOD试剂盒中各试剂按照说明书加入点样板后，分别加入20 uL待测样液作为实验组。将待测液换为SOD酶溶液进行点样作为光照对照组。强光直射30 min，出现明显的颜色变化，在酶标仪上进行测定。

2.2.4 正交试验的设计

根据每个单因素试验，得到相对较优的提取条件，进行多水平的实验设计选择较为敏感的水平和因素(表4、表5)[13]。

表4 正交设计实验因素水平

表5 正交设计实验因素

2.2.5 数据处理

本实验的数据处理及图表制作均采用Excel和SPSS等软件整理。

3 结果与分析

3.1 实验结果及分析

3.1.1 提取溶剂pH值的确定

pH值为7.2的PBS溶液OD值最大，后随着pH值的增加，OD值反而越来越小。所以pH值为7.2的PBS为较好的提取溶剂,并用于后续单因素试验(图1)。

图1 提取溶剂pH对SOD值的影响

3.1.2 提取料液比的确定

料液比在1∶1～1∶5时，随着浸取液的增加OD值不断增加，并在1∶5处得到最大值0.411。料液比为1∶5～1∶7的OD值呈现下降趋势，可选择在料液比为1∶5或1∶6。为节约试剂,可选择料液比1∶5用于后续正交实验(图2)。

图2 料液比对SOD值的影响

3.1.3 浸提时间的确定

从图3中可得，浸提时间从0.5 h到1.5 h，OD值不断向上增长，在1.5 h出现最高点，值为0.485，1.5 h后呈现下降趋势。所以浸提时间选择1.5 h。

图3 溶剂浸提时间对SOD值的影响

3.1.4 超声功率的确定

随着超声功率的升高OD值出现缓慢上升的趋势，这是因为通过超声机械振动可加快分子间的运动速度和频率，增加提取溶剂的提取效果率。但随着超声功率升高到900 W，OD值下降。综上，在900 W处有最大值,为最优的超声提取功率(图4)。

图4 超声功率对SOD值的影响

3.1.5 超声时间的确定

随着超声时间的延长，OD值呈上升趋势，30 min达到最大值0.469，之后随时间的延长呈下降趋势。因此选择超声时间30 min进行后续实验(图5)。

图5 超声时间对SOD值的影响

3.2 正交试验确定最优提取条件

正交实验得出SOD的最佳提取条件为：以pH值为7.1，0.05 mol/L的PBS缓冲液为提取溶剂，在料液比为1∶4，用超声进行辅助提取，超声时间和功率为28 min、800 W。正交试验得到最佳组合为A1B1C1D1以及各因素的关键性对比为D(超声时间)>B(料液比)>A(提取溶剂)>C(超声功率)(表6)。

表6 正交设计实验因素结果

4 结论

在芒果SOD的提取及抗氧化能力的实验中，考察了提取溶剂pH值、超声功率、超声时间、料液比、浸提时间5个影响因素。正交实验得到最佳的组合为pH值为7.1，0.05 mol/L的PBS缓冲液为提取溶剂，料液比为1∶4，超声时间和功率为28 min、800 W进行辅助提取。通过实验得到最佳的提取条件，为芒果SOD的提取提供了参考。