基于液相色谱法高效测定广东某地土壤中醛酮类化合物研究

钟 声，施颖娜

(1.深圳市深港联检测有限公司,广东 深圳 518133;2.深圳市华尔信环保科技有限公司,广东 深圳 518133)

1 引言

环境中存在的大部分醛酮类化合物均具有刺激性和毒性，会刺激人的眼睛、皮肤、鼻子和肺部，长此以往会给人体带来难以挽回的伤害，而且具有一定的遗传毒性[1,2]。例如甲醛已被确定为致癌和致畸性物质，能够影响免疫力，还具有生殖毒性，需要引起人们的警惕。土壤中的醛酮类化合物一旦溶解到地下水中，进入生态系统循环，会严重危害人体健康。液相色谱法就是用液体作为流动相的色谱法，其分离原理主要是基于混合物中各组分对两相亲和力的差别[3～5]。

目前对于醛酮类化合物相关研究主要是集中于环境空气中，对土壤方面的研究较少。对不易挥发的高沸点、热稳定性较高、分子链长、极性不一致的高分子化合物可以普遍用于高效液相色谱法。满足这种性质的分子大部分为石化产品、食品以及生物化工产品，大约占目前已知有机物的80%[6,7]。前期国内已经制定了液相色谱法测定土壤中醛酮类化合物的标准，已有学者对液液萃取溶剂的选择和液液萃取的方式进行了对比[8～10]。

本文则以广东某地的土壤为样本，基于液液萃取和固相萃取两种方式，利用液相色谱法来测定其中所含的醛酮类化合物含量。

2 实验方案

2.1 所用试剂及仪器

高效液相色谱仪具备紫外监测功能，日本进口；恒温振荡器，常州澳华仪器生产；色谱柱(SHIMADZUVP-ODS)型，日本进口；超纯水机，美国进口；高温箱式养护仪器，泰斯特公司生产；HLB固相萃取仪器，美国进口；固相萃取装置，美国进口；移液枪(Thermo 10 mL)；万分之一天平；平行浓缩仪，北京莱伯泰科公司生产；反转式振荡器(长沙永乐康仪器公司生产)；C18固相萃取仪器，德国CNW公司生产。

15种醛、酮类化合物标准浓度溶液(浓度为1000 mg/L)；2,4-二硝基苯肼标准溶液(浓度为1000 mg/L)；乙腈(色谱纯)，国药集团生产；二氧化硅、柠檬酸钠；缓冲溶液:使用柠檬酸和柠檬酸钠按照一定比例混合后,加水溶解并稀释,保证pH值约为3；醋酸-醋酸钠提取剂：将一定量的醋酸钠溶于水后与冰醋酸混合，然后加水稀释。DNPH衍生剂:将3.00 gDNPH溶于乙腈中，保证其容量为1 L[11]。

2.2 实验条件

在35 ℃的养护条件下维持34 min，使用60%乙腈+40%水进行持续的洗刷，保证流速稳定在1.0 mL/min，使用波长为360 nm的紫外线进行监测，使用样品的容量为10.0 μL[12]。

2.3 实验机理

醛酮类化合物中所含有的氧原子可以与水中的氢原子结合形成氢键，根据相似相溶原理，分子链较短的醛酮类物质能够与水互溶。醋酸的醋酸钠溶液能够将土壤中所含的醛酮类化合物进行提取。在一定温度和化学条件下，醛酮类化合物可发生衍生化反应，从而生成较为稳定的腙类化合物，经过萃取浓缩、色谱分离、紫外检测等步骤后，再对其进行物质定量测试[13]。

2.4 实验方法

将10.00 g的待测样品置于容量为250 mL的提取容器中，向其中加入200 mL的提取机进行密封，置于振荡器中振荡18 h，然后对样品进行过滤，收集提取到的样品，取100 mL的样品放于平底烧瓶中，向其中加入缓冲剂和衍生剂，使用超声波清洗器进行衍生，保持40 ℃的温度条件持续超声30 min。向衍生得到的溶液中加入10 mL氯化钠溶液，使用固相萃取柱进行完全萃取，用乙腈进行持续洗脱，最后定容至10 mL，依据上文条件进行结果测定。

2.5 实验操作

按照标准实验方法进行操作，对土壤的操作主要分为以下几个阶段：提取、衍生、萃取以及浓缩。为了保证实验效果，在密闭环境中进行提取及衍生操作，萃取浓缩过程应当对整个过程中的气密性、甲醛测试值进行全面监测，避免实验结果的干扰[14]。

实验过程中要确保液体以3～5 mL/min的速度通过固相萃取小柱，用20～30 min的时间确保100 mL衍生液全部通过小柱。在萃取时间为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min时对甲醛含量进行测试，以此得到甲醛含量与萃取时间的关系[15]。

将衍生液放在三角瓶中进行时长约为30 h的萃取浓缩。设置2组对照实验，观察萃取物理环境对于样品的影响。第一组使用锡箔纸将三角瓶的瓶口进行包裹，以减少液体与空气的接触；第二组则不做额外处理，直接将瓶口暴露在环境中。实验结果表明，敞口放置的样品测试结果明显高于使用锡箔纸包裹的样品。

为了提高萃取效率，在萃取过程结束后继续抽吸1 min。分别测试抽吸1 min、5 min、10 min和15 min情况的甲醛测试值的影响。实验结果表明，甲醛含量分别18.8 μg/L、35．6 μg/L、67．8 μg/L和70．3 μg/L，表明随着抽吸时间增加，甲醛测试含量增加，在时间超过5 min后，增加值明显；超过10 min以后，增加较为缓慢。

3 实验结果分析讨论

3.1 液相色谱柱的选择

本文选择了ZORBAXSB-C18(4.6×250 nm,5 μm),ZORBAXEclipseXDB-C18(4.6×250 mm,4 μm),ZORBAXODS(4.6×250 mm,5 μm)3种不同的液相色谱柱对15种醛酮类-DNPH的分离效果，结果如图1。

注：1～15分别代表：甲醛;乙醛;丙烯醛丙酮;丙醛;丁烯醛;丁醛;苯甲醛;异戊醛;正戊醛;邻-甲基苯甲醛;间-甲基苯甲醛;对-甲基苯甲醛;正己醛;2,5-二甲基苯甲醛

根据上图图谱显示可以看出使用SB-C18色谱柱，对大多数的目标化合物具有较好的分离效果，响应值和波形图较为理想，但对间-甲基苯甲醛和对-甲基苯甲醛的区分效果不好。XDB-C18色谱柱同样能够较好地分离15种醛酮类化合物，虽然该色谱柱对-甲基苯甲醛和间-甲基苯甲醛的分离效果达不到理想的效果，但是可以基于积分参数对两种化合物进行单独计量，本文为方便计算将其视为一类进行计算。ODS色谱柱虽然也有同样的效果,但是其峰值时间过于短暂，对土壤的基质的干扰性很强，最终的目标物确定较为复杂,最终在此次实验中选择ZORBAXEclipseXDB-C18色谱柱。

3.2 样品提取方式的选择

在空白土壤样品中加入一定量的醛酮类混合标准溶液作为对照组，提取方式最终选择3种进行：探头式超声、振荡、超声清洗器。其中振荡和超声清洗按照标准的实验方案进行;首先将衍生剂提取剂进行混合，然后加入待测样品中，保证边提取边发生衍生化反应，以便取得更好的探头式超声效果。得到如图2所示的实验结果。

图2 3种提取方式下的醛酮类化合物的回收率

从图2实验结果进行分析，探头式方式回收率与超声清洗器得到结果相差不大，探头式略高一些，振荡提取的效率明显高于其他两种方式，所有醛酮类化合物的回收率基本上都达到要求，普遍都超过了70%，所以在本次实验中最终选用振荡提取的方式提取土壤中的醛酮类化合物。

3.3 萃取方式的对比

这里对液液萃取和固相萃取两种方式的回收效果进行比较。首先制备相同数量相同条件下加入醛酮类化合物的空白土壤样品,利用两种萃取方式对固相进行萃取。液液萃取的操作步骤为：将1.5 g NaCl加入衍生后的提取液之中，然后使用二氯甲烷进行两次萃取，使用量分别为15 mL和10 mL，利用无水硫酸钠对萃取液进行脱水，进一步使用氮气进行持续吸水进行浓缩，最后更换溶剂为乙腈，进行定容至10 mL，对其进行均匀搅拌，最终得到实验结果如图3。

图3 2种萃取方式得到醛酮类化合物的萃取效果

从图3可以看出，2种方式回收率相差不大，固相萃取方式回收率大多高于液液萃取，二者相差不大，仅有对于甲醛的萃取误差超过10%，使用2种方式对土壤中醛酮类化合物进行测试均可以，本文采用固相萃取的方式进行测试。

3.4 萃取条件的优化

3.4.1 萃取次数

将2组完全一样的加入目标物质的进行衍生后得到的提取液进行固相萃取操作。其中一组使用C18固相萃取柱萃取后，经过乙腈洗脱，收集洗脱液，并定容至10 mL;另一组采用同样的步骤进行2遍洗脱后，然后定容至10 mL。对以上试验结果进行分析，发现萃取次数对于土壤中醛酮类化合物的回收效果影响并不大，萃取1次完全可以实现相对较好的萃取效果。对于个别含量较高的样品，可能需要进行多次萃取能够实现较高的样品回收效果。

3.4.2 洗脱溶剂

固相萃取的原理是依据根据对不同化合物的吸附性和选择洗脱性，从而实现对目标物质富集、分离和净化的效果，本文经过研究后最终选择使用二氯甲烷和乙腈2种溶剂进行洗脱。

根据洗脱溶剂不同而得到分离效果进行分析，2种洗脱溶剂对于醛酮类化合物的分离结果相差不大，对于极性较弱的化合物，使用二氯甲烷能够取得较好的结果，对物质结构进行分析，可知是由于二氯甲烷的极性小于乙腈，导致二氯甲烷的效果较好，而在使用中发现乙腈淋洗结果回收更为稳定，不需要额外的转换溶剂，本试验最终选择乙腈作为淋洗溶剂。

3.5 标准曲线与检出极限

使用乙腈分边将0.00、5.00、8.00、20.0、50.0、100μL的醛酮类-DNPH标准溶液稀释至1 mL,使用标准系列溶液浓度区间为:0.00～1.50 μg/mL。根据仪器要求进行样品分析,横坐标为标准溶液中醛酮类化合物的浓度，纵坐标则为其对应的图形面积，绘制标准曲线，得到回归表达式如表1。

对检测得到样品浓度的4倍样品进行连续测定20次,根据标准偏差S计算方式得到检出限。计算方法为MDL=t(n-1,0.99)×S,式中t(9,0.99)=2.821,结果见表1。

表1 醛、酮类标准曲线和检出限

3.6 精确度与准确度测试

根据上述试验方法对目标类化合物添加浓度为0.20 mg/kg、0.50 mg/kg、2.00 mg/kg的空白土壤样品进行9次重复测定,根据试验计算平均回收率和偏差实验结果如表2所示。

表2 平均回收率和偏差试验结果

根据表2可以看出，丙酮的平均回收率为47%，醛类化合物的平均回收率均超过60%，范围为67%～83%,相对标准偏差均低于15%，范围为9%～13%。分析丙酮回收率较低是根据相似相溶原理丙酮能够溶于水。

4 结论

采集广州某化工企业土壤样品,按照上述分析所用试剂、流程、方法进行化合物含量测定，经过多次的测量、数据分析，得到该土壤样品中含有的甲醛为1.53 mg/kg、乙醛为0.67 mg/kg，其他醛酮类化合物含量极低未在样品中检出。

本次研究经过了提取溶剂、衍生反应、C18萃取柱固相萃取、液相色谱法对土壤样品中含有15类醛酮类化合物的含量进行测试。分析对比不同色谱柱、提取方式和萃取方法的测试效果对比，固相萃取条件进一步优化。此方法实验效果优良，数据稳定，样品回收率高，方便操作，误差较小。可以在后期土壤污染程度的测试中推广，作为一种经验建议。