柑橘溃疡病生防微生物研究进展

李奇聪, 金秋珠, 骆海玉*, 颜桢灵, 邓业成*, 邓志勇

(1.珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室(广西师范大学), 广西 桂林 541006；2.广西漓江流域景观资源保育与可持续利用重点实验室(广西师范大学), 广西 桂林 541006；3.广西珍稀濒危动物生态学重点实验室(广西师范大学), 广西 桂林 541006；4.广西师范大学 可持续发展创新研究院, 广西 桂林 541006)

柑橘溃疡病是由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种(Xanthomonascitrisubsp.citri，同物异名为X.campestrispv.citri或X.axonopodispv.citri)引起的一种细菌性病害[1]，是柑橘生产中的重要病害之一，对全球柑橘产业发展具有巨大破坏作用[2-4]。病原菌在柑橘幼果期或新梢抽发期通过气孔、伤口等渠道侵染植物果实、叶片及枝梢。植株感染柑橘溃疡病菌后形成水渍状病斑，后期病斑逐渐木栓化并呈现火山口状。染病严重时可造成植株叶片和果实大量脱落，影响果实品质，并造成大量减产，甚至导致植株死亡，严重影响经济效益[5-6]，每年需大量化学药剂对其进行防治，但由此引起农药残留、环境污染、耐药性等一系列问题，严重阻碍了柑橘产业的健康绿色发展之路[7-8]。近年来，具有广谱、高效、环境相容性好等特点的生物防治方法，尤其是微生物防治逐渐被重视，国内外越来越多研究者围绕微生物防治柑橘溃疡病开展研究。

生防微生物是指那些可以用于防治植物病害的有益微生物。自然界中存在大量可以抑制植物病原菌的拮抗微生物，生防微生物自身或其代谢产物具有多种生物活性，可用于抑菌、杀虫、抗氧化等领域。通过微生物繁殖和微生物发酵可制成微生物活体农药和微生物代谢产物农药，而实现农业的绿色经济可持续发展离不开对生防微生物的研究开发。

近年来，关于柑橘溃疡病生防微生物的研究逐渐增多，包括利用细菌、放线菌、真菌和噬菌体进行生物防治。本文对近20年来用于柑橘溃疡病防治的微生物的最新研究进行综述，以期为柑橘溃疡病生物防治的进一步研究提供参考，不断推进我国柑橘溃疡病的科学、高效防治及可持续治理技术的应用。

1 生防细菌及其作用机制

拮抗细菌及其代谢物的使用被认为是一种很有前途的植物保护策略，已有较多研究从柑橘叶片、果实及柑橘果园的土壤中分离出对柑橘溃疡病菌具有拮抗作用的细菌。目前研究较多的柑橘溃疡病菌拮抗细菌包括芽孢杆菌Bacillussp.、假单胞菌Pseudomonassp.和其他菌种(表1)。

1.1 芽孢杆菌及其作用机制

芽孢杆菌在自然界中广泛存在，不仅是植物根际、土壤等外界环境中常见的微生物，更是植物体内常见的内生细菌。芽孢杆菌除可以产生芽孢外，还具有抗逆能力强、繁殖速度快、营养要求简单、能产生多种抗菌活性物质等优势[9]，因此成为植物病原菌拮抗细菌研究的重点和热点[10]。目前国内外已经发现许多对柑橘溃疡病菌有拮抗作用的芽孢杆菌属细菌，主要包括枯草芽孢杆菌B.subtilis、解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens和短小芽孢杆菌B.pumilus等(表1)。

应用筛选出的芽孢杆菌活菌株或菌剂防治柑橘溃疡病取得了显著效果。例如：Das等[11]发现在田间实验条件下，喷施枯草芽孢杆菌B.subtilisS-12悬浮液(含细胞2.7×109个/mL)的柑橘植株发病率显著下降；Daungfu等[12]发现从柑橘属植物中分离得到的解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciensLE109的细胞悬浮液和提取物可完全控制柑橘叶片溃疡病的发生；陈娇梅等[13]研究发现，与单独使用短小芽孢杆菌B.pumilusYH1菌体或代谢产物相比，使用其培养液(菌体+代谢产物)对离体叶片上柑橘溃疡病的防治效果更佳。

研究芽孢杆菌的防治机制发现，其可能通过菌体或产物发挥防治作用，也可能通过诱导宿主相关防御酶的产生，提高宿主抗病能力而产生作用。陈力等[14]利用对峙培养法筛选到1株对柑橘溃疡病菌具有较强抑制作用的枯草芽孢杆菌B.subtilisCQBS03，其对柑橘溃疡病菌具有抑菌活性的物质可能为外泌型蛋白。陈娇梅等[13]筛选出对柑橘溃疡病有较好防效的3株芽孢杆菌属菌株均具有较强的蛋白酶活性。赖家豪等[15]研究发现3株对柑橘溃疡病有防治效果的内生细菌(其中包含2株芽孢杆菌)，均可不同程度地诱导和增强脐橙树体内防御酶的活性。

综上所述，尽管国内外已筛选出多株对柑橘溃疡病菌有拮抗作用的芽孢杆菌，但关于芽孢杆菌拮抗柑橘溃疡病菌具体机制的研究还比较缺乏，具体抑菌活性物质的分离鉴定也极少报道，大多研究均直接使用芽孢杆菌活菌株或菌剂来防治柑橘溃疡病，田间效果稳定性难以得到保证，需要深入研究拮抗芽孢杆菌在田间果园的最佳定殖条件以及作用的活性物质，使拮抗菌以最有效的方式定殖于植株，或以最有效成分作用于植株，从而使其生防潜力得到更大发挥。

1.2 假单胞菌及其作用机制

与芽孢杆菌相似，假单胞菌抑制病原体和产生抗菌活性物质的生防潜力一直是研究的热点。假单胞菌是土壤中广泛分布的需氧型革兰氏阴性菌，是一类不呈螺旋状、或直或微弯，无菌柄和鞘，不产芽孢的杆菌[16]。它是植物根际较普遍的微生物类群之一，此类细菌的多数种类株系都具有拮抗作用。对柑橘溃疡病菌具有拮抗作用的菌株有荧光假单胞菌P.fluorescent、铜绿假单胞菌P.aeruginosa等，详见表1。

巴西隆德里纳州立大学Andrade研究团队筛选出对柑橘溃疡病菌有拮抗作用的多株假单胞菌，例如铜绿假单胞菌P.aeruginosaLV、P.aeruginosaLN和假单胞菌Pseudomonassp. LN等，并对这些菌株的次生代谢产物进行分离，以评价代谢产物的抑菌活性。该研究团队Oliveira等[17-18]报道了从感染柑橘溃疡病的病叶中分离得到的铜绿假单胞菌P.aeruginosaLV次生代谢产物对柑橘溃疡病的防治效果，发现其二氯甲烷提取物以及通过活性追踪得到的活性组分F3在温室条件下能有效减少柑橘溃疡病斑形成，与未经处理的柑橘植株相比，病斑分别减少80%和94%；并从活性组分F3中分离得到一个具有活性的天然有机铜抗生素类化合物(OAC)。此外，该研究团队Spago等[19]发现铜绿假单胞菌P.aeruginosaLN的活性组分VLC4f在温室条件下可减少柑橘植株94%的溃疡病斑。

阿根廷图库曼国立大学Adler团队[20]则从假单胞菌代谢物中提取嗜铁素(siderophores)，并研究嗜铁素对柑橘溃疡病菌的拮抗活性。从拮抗柑橘溃疡病菌的铜绿假单胞菌P.aeruginosa发现具抗生素活性的绿脓杆菌螯铁蛋白(pyochelin)。随后，团队成员先后从对柑橘溃疡病菌有拮抗作用的荧光假单胞菌P.fluorescens和假单胞菌P.protegensCS1中均提取到新的活性物质enantio-pyochelin[21-22]；同时，评估添加铁和抗坏血酸对其抗菌能力的影响时，发现补充铁并未影响柑橘溃疡病菌对enantio-pyochelin的敏感性，而补充抗坏血酸则大大降低了其敏感性，表明氧化应激反应可能参与了enantio-pyochelin对柑橘溃疡病菌的抑制机制[21]。柑橘溃疡病菌对氧化胁迫的耐受能力较低[21]，结合细菌氧化应激的防治策略值得考虑。

目前，关于假单胞菌在植物病害生物防治中的作用机制，研究认为它通过分泌一种或几种抗生物质来抑制病原菌的生长[23]，所以生防假单胞菌的研究多集中在从次生代谢产物中筛选活性化合物。国外相关研究较为成熟的团队主要报道筛选具拮抗作用的假单胞菌，提取、纯化具拮抗活性的化合物，但目前筛选到的化合物应用到生产中的还较少。

1.3 其他菌种

除了芽孢杆菌和假单胞菌外，有研究团队筛选到具拮抗作用的其他菌种。例如，张洪波等[24]从柑橘叶表筛选得到2株对柑橘溃疡病菌有较好抑制作用的菌株Kx15和Kx48，在温室内对柑橘溃疡病的防治效果分别为45.6%和55.6%，在果园中对柑橘溃疡病的防治效果分别为40.3%和47.7%，经鉴定分别为葡萄糖杆菌属Gluconobacter和乳酸杆菌属Lactobacillus。Gholami等[25]从土壤和受柑橘溃疡病菌侵染的柑橘健康茎中，分别得到对柑橘溃疡病菌具有显著抑制作用的克罗诺杆菌Cronobactersp. DGH1和肠杆菌Enterobactersp. DGH3。

表1 对柑橘溃疡病菌具拮抗作用的细菌

2 生防放线菌及其作用机制

放线菌能产生多种拮抗物质，也成为生物防治领域重点研究的一类微生物。目前从微生物中发现的生物活性物质超过50%由放线菌产生[41]，有多种抗生素已广泛应用到病害防治，例如目前常用的农用链霉素、春雷霉素及中生菌素。从放线菌中筛选出柑橘溃疡病菌的拮抗菌株，开发生防药剂成为了柑橘溃疡病生物防治的重要研究方向之一。目前已报道的对柑橘溃疡病菌具拮抗作用的放线菌主要为链霉菌属菌株，详见表2。

Wattana-Amorn等[42]从链霉菌Streptomycessp. strain 22-4提取到对柑橘溃疡病菌有抑制作用的2个环二肽化合物cyclo(L-Pro-L-Tyr)和cyclo(D-Pro-L-Tyr)。马冠华等[43]通过平板对峙培养法筛选出3株对柑橘溃疡病菌有拮抗作用的放线菌，其抑菌圈直径达42.0～60.0 mm，同时，发现其粗提物可提高柑橘溃疡病菌菌液电导率、还原糖与蛋白质含量，推测是通过影响溃疡病菌细胞壁和细胞膜通透性起作用。

目前有关放线菌防治柑橘溃疡病的应用及作用机制报道较少，从放线菌中筛选柑橘溃疡病菌的拮抗菌株数量及菌属分布也较为有限，而开发柑橘溃疡病放线菌生防剂具有巨大潜力，后期还可继续扩大筛选范围，并加大应用安全性及作用机制方面的研究。

表2 对柑橘溃疡病菌具拮抗作用的放线菌

3 生防真菌及其作用机制

作为拮抗柑橘溃疡病菌的一类生防微生物，真菌在柑橘溃疡病菌生物防治方面具有巨大的开发潜力，但对真菌的研究程度低于细菌。目前已报道的对柑橘溃疡病菌具拮抗作用的真菌如表3所示。考虑到来自极端环境的真菌产生活性代谢物的潜力，2018年Vieira等[49]从南极土壤和海洋沉积物的真菌中提取对柑橘溃疡病菌有拮抗作用的次生代谢产物，发现陆地(土壤)和海洋(沉积物)真菌提取物的平均抑制率分别为94%和97%；对产生抗菌活性代谢产物的菌株进行鉴定，归为5个不同属：假裸囊菌属Pseudogymnoascus，青霉属Penicillium、Cadophora属，拟盾壳霉属Paraconiothyrium和Toxicladosporium属。该团队2021年报道了从南极洲海洋沉积物筛选得到的青霉菌Penicilliumsp. CRM1540活性产物的分离和鉴定，获得活性化合物青霉酸(penicillic acid)；当该化合物浓度为25 μg/mL时，对柑橘溃疡病菌的体外抑菌率达90%，在活体试验中，与对照组相比，可有效减少甜橙Citrussinensis(L.) Osbeck叶片中柑橘溃疡病75.37%的病症(以病斑数量计)[50]。Xie等[51]研究丛枝菌根真菌Paraglomusoccultum对柑橘溃疡病的防治效果，结果表明，预先接种丛枝菌根真菌的柑橘对溃疡病抗性明显增强。颜桢灵等[52]从不同抗病品种的健康柑橘植株不同组织中分离纯化得到72株内生真菌，并测定其中30株内生真菌发酵提取物对柑橘溃疡病菌的抑菌活性，结果显示，29株内生真菌表现出不同程度的抑制活性。

对于生防真菌作用于柑橘溃疡病菌的相关机制报道极少。Xie等[51]研究发现接种丛枝菌根真菌P.occultum(AMF)的柑橘与未接种的相比，其根部过氧化氢(H2O2)、一氧化氮(NO)、钙调蛋白(CaM)和水杨酸(SA)的积累明显增加，同时伴随着根部PtEPS1(enhance pseudomonas susceptibility 1)和PtPR4(pathogenesis related gene 4)表达水平上调，表明预先接种AMF真菌的柑橘植株可通过增加信号底物的积累和病原菌防御基因的表达而对柑橘溃疡病菌的侵染产生更强的抵抗力。

以上研究表明，一些特境真菌，包括极端环境真菌(南极土壤真菌)、海洋真菌、植物内生真菌等，具有产生抑制柑橘溃疡病菌活性产物的巨大潜力，但目前相关研究报道仍较少，有待进一步深入开发和利用。

表3 对柑橘溃疡病菌具拮抗作用的真菌

4 噬菌体及其作用机制

使用噬菌体作为柑橘溃疡病防治剂也是一种生态友好型的防治方法。噬菌体是一种感染细菌的病毒，是环境的天然组成部分，特异性强、呈指数传播等优势使它们成为一种优良的生物防治剂。但国内关于利用噬菌体防治柑橘溃疡病的研究较少，国外关于噬菌体生物农药的研究相对较为成熟(表4)。Ahmad等[53]分离并鉴定了能够感染柑橘溃疡病菌的丝状噬菌体F1，同时发现F1可引起受其侵染的柑橘溃疡病菌细胞的几个生理变化，包括胞外多糖产生水平降低、活力降低、生长速度减慢、毒力显著降低，尤其是柑橘溃疡病菌毒力的降低，表明噬菌体F1具有被用作防治柑橘溃疡病生防剂的潜力。同年，Ahmad等[54]还报道了能有效附着在宿主细胞(包括耐药菌株)的2株噬菌体Cp1和Cp2。其中，Cp1可以普遍裂解从日本不同地区分离得到的柑橘溃疡病病株[55]。2018年，Yoshikawa等[56]报道发现1株新型噬菌体N1，该噬菌体具有384 670 bp超大基因组，且比其他感染柑橘黄单胞菌的噬菌体具有更广泛的宿主特异性，可能成为柑橘溃疡病噬菌体生物防治的候选菌株。肖逍等[57]分离获得1株烈性噬菌体P9，体外裂解测定发现其对供试的柑橘溃疡病菌具有快速杀菌能力，30 min可以杀灭90%的宿主菌，150 min就可以彻底清除宿主菌，经鉴定属于有尾噬菌体目Caudovirales短尾噬菌体科Podoviridae。

噬菌体在柑橘溃疡病防治中表现出较大潜力，但将噬菌体用于柑橘溃疡病的防治还面临很多难题，例如噬菌体在柑橘叶表的残留时间短，噬菌体需要在高浓度条件下才能进行有效控制疾病害[58]。噬菌体处理是一种很有前途的柑橘溃疡病防治新方法。利用噬菌体防治柑橘溃疡病或生产无溃疡病苗木是否经济可行、效果满意，尚需进一步评价。

表4 对柑橘溃疡病菌有拮抗作用的噬菌体

5 总结与展望

我国利用生防微生物对柑橘溃疡病进行生物防治的研究主要集中在筛选对柑橘溃疡病菌有拮抗作用的芽孢杆菌和放线菌，而国外在生防细菌、生防真菌和噬菌体方面均有研究。国外研究不局限于微生物活体的筛选，还注重筛选有活性的代谢产物，例如Andrade研究团队历经多年，从铜绿假单胞菌代谢物中分离得到对柑橘溃疡病菌有较强抑制作用的天然有机铜化合物，但尚未进行结构鉴定；Adler团队从荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌和防御假单胞菌提取嗜铁素，并研究其对柑橘溃疡病菌的抑菌机制。与国外相比，我国对柑橘溃疡病生防微生物的研究范围比较狭窄，研究层次比较浅，还处在筛选拮抗菌的阶段，尚未对活性物质进行分离纯化，具体抑菌机制也有待深入研究。

国内外报道的大多数生防微生物研究还停留在室内实验和中试阶段。在离体与活体2种条件下，拮抗菌株对病菌的拮抗能力不一定存在正相关关系，即筛选得到的菌株在实验室对病原菌的抑菌效果强，却不一定是田间可应用的最好生防菌。既能在田间环境中产生有效拮抗物质，又能适应环境在植株上很好定殖，才是具有应用价值的生防菌。因此，柑橘溃疡病菌生防微生物的研究应由实验向实际生产运用方向发展，注重田间防治效果。

综上，目前对柑橘溃疡病生防微生物的研究主要包括细菌、放线菌、噬菌体和真菌。其中，以细菌中的芽孢杆菌研究较多；从放线菌中分离得到一些活性物质，但筛选的菌株种类及数量均较少；对噬菌体及真菌防治柑橘溃疡病的研究相对较少。此外，当前生防微生物研究均缺乏具体防治机制的探讨，活性成分的分离鉴定也有待深入开展。未来一方面可扩大筛选范围，筛选不同来源微生物，例如近年来报道的植物内生真菌等特境微生物；另一方面，应加强田间试验的开展及安全性评估，促进生防菌的应用；此外，还需加强具体作用机制的研究，以期促进柑橘溃疡病生防菌的开发应用及柑橘产业的可持续发展。