基于线虫生物多样性的稻田镉污染土壤修复成效研究

邓普荣，姚 志，刘勇波

中国环境科学研究院，国家环境保护区域生态过程与功能评估重点实验室，北京 100012

近年来，农田土壤重金属污染问题备受关注.农田的重金属积累使得土壤肥力下降、土壤退化和可利用耕地面积减少[1-2]，且受污染农田的重金属通过食物链在植物、动物和人体内富集，威胁人体健康[3].为修复重金属污染的耕地，已采用物理、化学、生物和农业生态修复等技术方法，如客土法、热解吸法、土壤淋洗、植物和微生物修复、调整农田耕作制度等一系列农田重金属修复技术[4-5].通过施用钝化剂吸附、沉淀或络合重金属被广泛用于农田重金属的修复，降低重金属的流动性和生物利用率，从而减少重金属在食物链上的传递[6].

土壤重金属污染的修复技术发展日渐成熟，但对受污染农田的修复后评价，特别是针对土壤动物的群落特征及种群动态的监测常常被忽视[7].20 世纪80年代，荷兰线虫学家Bongers[8]将土壤线虫作为环境指示生物应用到污染土壤监测及恢复过程中.土壤线虫是土壤动物的一个重要类群，其种类繁多，分布广泛，参与土壤中有机质分解、植物营养矿化和养分循环等生态过程，在土壤生态系统中占有重要地位[9-10].土壤线虫的物种多样性、食性多样性和生活史策略多样性使其在变动的环境因子中，尤其是污染胁迫中作出迅速反应[11-12].土壤线虫不同营养类群的组成、数量及线虫群落结构的动态分析可直接反映土壤物质的代谢途径和食物链/食物网结构的变化，指示土壤生态系统中物质和能量的流动情况，进而在生态系统功能水平上揭示土壤环境健康状态[13-16].

该文在镉污染稻田土壤中采用施加钝化剂、钝化剂+净水和喷施叶面肥三种修复措施，分析水稻农田生态系统中土壤线虫的物种组成、丰富度、群落结构、食物网动态及群落的结构变化，评价修复措施对Cd 污染稻田土壤修复的生态效应，以期确定能否采用土壤线虫多样性指数来指示农田重金属污染的修复成效.

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于湖南省长沙市长沙县农田(28°15′N、113°14′E)，占地面积约0.37 hm2.表层土壤中Cd 的浓度范围为0.40～0.80 mg/kg，超过《土壤环境质量标准》(GB 15618—2018)农用地土壤Cd 污染风险筛选值(0.4 mg/kg)，而其他重金属含量均低于GB 15618—2018 相关限值.

试验田种植了早稻“中早39”和晚稻“玉针香”，水稻种子由湖南省农业科学院提供.育苗前用5%的次氯酸钠溶液消毒15 min，用自来水冲洗.稻田其他管理遵循长沙县当地水稻常规操作流程.

1.2 土壤修复技术与线虫取样方法

该试验采用3 种土壤修复方法，即施用钝化剂、钝化剂+净水、喷施叶面肥[17].钝化剂的主要成分是赤泥、磷矿粉、海泡石，三者质量比为2∶1∶1；使用时按1 kg 农田土添加2 g 钝化剂(包括赤泥0.10%、磷矿粉0.05%、海泡石0.05%)，即钝化剂含量为0.2%；以1 hm2农田施用300 kg 钝化剂的比例向农田中施用钝化剂.叶面肥中1.0 g/L 的硅来自Na2SiO3，0.5 g/L的磷来自NaH2PO4，1.5 g/L 的硒来自Na2SeO3，0.5 g/L的硫来自Na2S，0.5 g/L 镁的来自MgCl2.3 种土壤修复方法分别在3 块农田中进行，并设置蒸馏水喷施作为对照组(CK)，共4 种处理，每种处理均设3 个重复地块，地块面积40～135 m2.在水稻种植的苗期(25～35 d)、分蘖期(60～70 d)和开花期(80～90 d)分别施用钝化剂和喷施叶面肥.

于5 月22 日、7 月16 日、9 月23 日和10 月22 日在长沙县试验地收集土壤样品，为随机取样.每次在各地块中的3 个样点采集3 份重复土壤，取样深度为0～30 cm.利用重糖离心法分离土壤线虫，称取100 g土样，放入1 000 mL 烧杯内，加水至300 mL，浸泡30 min；过60 目(0.25 mm)、100 目(0.15 mm)和500 目(0.025 mm)筛，收集筛上的线虫和卵，倒入离心管中离心(分离线虫，3 000 r/min，离心5 min；分离卵，3 000 r/min，离心3 min)；把上清液倒掉，加蔗糖(分离线虫加70%的蔗糖液，分离卵加35%～40%的蔗糖)，离心(同上)，过500 目(0.025 mm)筛，收集筛上的线虫和卵，在解剖镜下记数并鉴定到属[18].

1.3 生物多样性指数和生态功能性指数计算

1.3.1 土壤线虫生物多样性指数

物种多样性指数选用多样性指数、优势度指数、均匀度指数和丰富度指数.

Shannon-Wiener 多样性指数(H′)：

Simpson 优势度指数(C)：

Pielou 均匀度指数(E)：

SR 丰富度指数：

式中，Pi为第i种线虫的个体数占调查个体总数的比例，N为所调查到的总个体数，S为所调查的物种总数.

1.3.2 土壤线虫生态功能性指数

生态功能指数选用成熟指数(MI 指数)、植物寄生线虫成熟指数(PPI 指数)、线虫富集指数(EI 指数)、线虫结构指数(SI 指数)、线虫通路比值(NCR 值)和瓦斯乐斯卡指数(WI 指数).

MI 指数：

式中，Cpi为第i种线虫的c-p 值(colonizer-persister value)，c-p 值根据自由生活线虫在生态演替中的不同生活策略，分别赋值为1～5.根据线虫在r 对策到k 对策的生活史策略连续谱中的位置，将线虫划分为5 个c-p 类群：c-p 1 为典型的机会主义者，世代时间极短，卵量巨大，在食物丰富的条件下种群暴发，极耐污染和环境压力；c-p 2 也是机会主义者，世代时间短，卵量大，较耐污染和环境压力；c-p 3 世代时间较长，对环境压力较敏感；c-p 4 世代时间长，对环境压力敏感；c-p 5 则为典型的k 对策者，世代时间很长，卵量小，对污染和环境压力极为敏感[8,19].

PPI 指数：

式中，Pi′为植物寄生性线虫在线虫种群中的占比，m为所调查植物寄生性线虫的物种总数.

MI 指数和PPI 指数反映土壤线虫群落功能结构特征，用以评价人类干扰活动对土壤线虫群落的影响，MI 指数反映自由生活线虫的成熟度，PPI 指数反映植物寄生线虫的成熟度，较低的MI 指数表明土壤生态系统扰动强烈，反之则表明土壤生态系统趋于稳定.

MI25 指数：

式中，Cpi25为c-p 值在2～5 之间的第i种线虫的c-p值，Pi25为第i种线虫的个体数占总个体数的比例，MI25 为c-p 值在2～5 之间的自由生活线虫的总成熟指数，n为c-p 值在2～5 之间线虫的物种总数.

EI 指数：

式中：EI 代表土壤线虫富集指数；根据线虫食性并结合线虫生活史特征，将线虫分为若干类群〔Bax、Fux、Ppx和Omx分别代表食细菌、食真菌、植食性以及杂食/捕食线虫(x取值为1～5，代表线虫的c-p 值)[20]〕，b代表食物网中的基础成分，主要指Ba2和Fu2这两个类群；e代表食物网中的富集成分，主要指Ba1和Fu2这两个类群；kb和ke为各类群所对应的加权数(在0.8～5.0 之间)；nb和ne则为各类群的丰度.

SI 指数：

式中：SI 为结构指数；s代表食物网中的结构成分，包括Ba3～Ba5、Fu3～Fu5、Om3～Om5和Pp2～Pp5类群；ks为各类群所对应的加权数；ns为各类群的丰度.

NCR 值：

式中：NBa为食细菌线虫数量，个；NFu为食真菌线虫数量，个.

WI 指数：

式中，NPp为植食性线虫数量，个.

EI 指数和SI 指数均在0～100 之间变化，二者结合分析可以较好地指示土壤环境的干扰程度和土壤食物网的变化.EI 指数主要用于评估食物网对可利用资源的响应，SI 指数指示在干扰或恢复过程中土壤食物网结构的变化.NCR 值主要用于指示土壤食物网的降解途径[14].

2 结果与讨论

2.1 土壤线虫群落组成

土壤线虫分析数据如表1 所示，共鉴定出线虫13 599 条，隶属于32 属，包括食细菌线虫13 属，占14.62%；食真菌线虫3 属，占1.72%；植食性线虫8 属，占22.10%；杂食/捕食线虫8 属，占61.55%.矛线属(Dorylaimus)、潜根属(Hirschmanniella)和托布利属(Tobrilus)为此水稻农田生态系统的优势属.

表1 试验稻田样地土壤线虫群落组成Table 1 Community composition of soil nematode in paddy fields

2.2 Cd污染土壤修复措施下线虫群落多样性的变化

土壤线虫的丰富度、物种数、生物多样性指数等在不同取样时间表现出显著差异(见表2).不同修复措施对水稻土壤线虫物种数、Shannon-Wiener 多样性指数、Simpson 优势度指数、Pielou 均匀度指数和SR 丰富度指数均没有显著影响，但对土壤线虫丰富度有显著影响(P＜0.05，见表2、图1、图2).

表2 3 种修复措施下稻田土壤线虫的生物多样性指数方差分析结果Table 2 F-values of ANOVAs for biodiversity indices of soil nematodes under three remediation methods at four sampling times in paddy fields

线虫丰富度的影响与取样时间有交互作用(见表2).多重比较分析不同月份3 种土壤修复措施下稻田土壤中线虫丰富度发现，在9 月和10 月线虫丰富度差异不显著，但在5 月和7 月差异显著(见图1).5 月，钝化剂处理的土壤中线虫丰富度最高，显著高于钝化剂+净水和叶面肥处理，但与对照组没有显著性差异.7 月，叶面肥处理的水稻土壤中线虫丰富度最高，显著高于钝化剂处理的水稻土壤，但与钝化剂+净水处理和对照组差异不显著(见图1).

2.3 Cd 污染土壤修复措施下土壤线虫生活史策略指数的变化

不同修复措施对水稻农田土壤线虫生活史策略指数—MI 指数、PPI 指数、MI25 指数等均有显著影响(见表3).土壤线虫MI 指数在不同处理之间有显著性差异(见表3)，多重比较分析发现，在5 月和9 月没有显著差异，但在7 月和10 月有显著差异，其中钝化剂+净水处理的土壤中线虫MI 指数最高，显著高于叶面肥处理的土壤，但与钝化剂处理和对照组的土壤均无显著差异(见图3).

表3 3 种修复措施下稻田土壤线虫的生活史策略指数方差分析结果Table 3 F-values of ANOVAs for life history strategy indices of soil nematodes under three remediation methods at four sampling times in paddy fields

植物寄生线虫PPI 指数在不同处理之间具有显著差异(见表3)，多重比较分析发现，在5 月、9 月和10 月差异不显著，但在7 月有显著差异(见图3).7 月，叶面肥处理的土壤中线虫PPI 指数显著低于钝化剂+净水处理的土壤，但与钝化剂处理和对照组的土壤均无显著差异(见图3).

由图3 可见：5 月，使用钝化剂处理的土壤中线虫MI 指数最低，显著低于对照组土壤，但与钝化剂+净水及叶面肥处理的土壤之间没有显著差异；7 月和10 月，叶面肥处理的土壤中线虫MI 指数最低，显著低于钝化剂+净水处理的土壤，但与对照组和钝化剂处理的土壤均无显著差异(见图3).

c-p 值在2～5 之间的自由生活线虫成熟指数(MI25 指数)能指示土壤状况的变化.由图3 可见，在7 月和10 月，不同处理间稻田土壤线虫群落MI25 指数有显著差异，但在5 月和9 月无显著差异.在7 月和10 月，叶面肥处理的土壤中线虫MI25 指数最低，显著低于钝化剂+净水处理的土壤，但与对照组及钝化剂处理的土壤均没有显著差异.

2.4 Cd 污染土壤修复措施下线虫生态功能指数的变化特征

不同土壤修复措施下线虫的生态功能指数(EI指数、SI 指数、NCR 指数和WI 指数)均没有显著差异(见表4 和图4).NCR 指数接近0，代表土壤有机质分解依靠真菌分解途径；若NCR 指数接近1，代表土壤有机质分解依赖细菌分解途径[21].所有样地的NCR 指数在0.6～1.0 之间，表明细菌是农田土壤有机质的主要分解分解者.该农田多数土壤样品的WI 指数＞1，表明土壤健康程度较好.

表4 3 种修复措施下稻田土壤线虫的生态功能性指数方差分析结果Table 4 F-values of ANOVAs for ecological functions of soil nematodes under three remediation methods at four sampling times in paddy fields

EI 指数与SI 指数联合使用时，以SI 指数(0～100)为横坐标、EI 指数(0～100)为纵坐标，以(50，50)为中心，将SI 指数和EI 指数的分布划分成4 个象限，这4 个象限分别代表食物网不同的特征.SI 指数指示土壤食物网连通性和食物链长度，其数值越大，表明相对连通性越高，食物链越长.EI 指数指示外界养分投入状况，其数值越大，表明外界投入养分相对越多.由图5 可见，在3 种稻田重金属Cd 的修复措施下，各处理的土壤线虫权重区系分析结果分布于B 和C 象限.分布于B 象限表明该水稻农田养分状况较好且受胁迫程度较低，食物网稳定成熟；分布在C 象限表明水稻农田肥力状况较差但受胁迫程度较低[22].

2.5 讨论

土壤线虫食性多样，占据食物链/食物网多个营养级，是土壤生态系统中的重要组成部分.土壤线虫因种类众多、繁殖力强、迁移能力差和对环境胁迫敏感，常作为评价土壤质量的指示生物[23-24].笔者试验研究了Cd 污染稻田在3 种修复措施下，土壤线虫的多样性及土壤线虫群落的结构和功能的变化，发现土壤线虫的丰富度、物种数、生物多样性指数和生态功能指数等在不同取样时间上有显著性差异.Yang等[25]对连续种植多年的转Bt基因水稻农田观测发现，取样年份和采样日期对根际土壤中线虫群落组成的影响比转Bt基因水稻处理更明显.这也证明土壤线虫随环境因子变化而变化，适合指示土壤理化性质、土壤肥力、土壤食物网结构和功能等动态变化[19,26].一般采用多种物理、化学和生物技术方法修复重金属Cd 污染土壤，如使用钝化剂和叶面肥等，这些可能改变土壤环境，从而影响土壤线虫群落.钝化剂通过升高稻田土壤pH 从而降低重金属Cd 从土壤到水稻的迁移率[27]，也能影响农田中线虫的群落结构和动态[28].喷施混合磷硫叶面肥影响地上部分作物的次生代谢产物进而影响土壤线虫群落[17].

钝化剂和钝化剂+净水的喷施均显著增加了稻田线虫成熟指数，且c-p 3、c-p 4、c-p 5 的线虫类群占据优势，该措施下农田生态系统受到的干扰减小，向着更成熟的阶段发展.叶面肥喷施处理部分降低了土壤线虫的MI 指数，增加了PPI 指数，且c-p 2～5 类群线虫的MI25 指数为所有处理间最低，这说明地上植被与土壤线虫群落之间为联动的系统.植被-土壤-土壤线虫之间存在的互动效应[29].Zhang 等[30]以森林生态系统为例，证明森林地上植被的种群结构会影响地下土壤线虫多样性和种群结构的维持.Hu 等[31]以高山草甸生态系统为例，证明放牧强度对土壤线虫群落有显著影响.叶面肥的喷施一定程度上促进了农田地上水稻作物的生长，进而影响了土壤线虫群落结构[32].在农田生态系统中，地上部分农作物的耕作也影响着土壤线虫的丰度.在试验中随着水稻的收获，土壤线虫丰度于7 月和10 月达到了峰值.水稻的收获使有机质在稻田土壤中积累，特别是在7 月，土壤线虫丰富度、物种数和Shannon-Wiener 多样性指数均达到峰值.Zhu 等[32-34]证明，适量的有机肥或秸秆还田都增加了土壤线虫的多样性，改变了土壤线虫群落的组成.

3 种修复措施对水稻土壤线虫的生态功能指数均没有显著影响.Park 等[35]对0～2.6 mg/kg 浓度梯度下Cd 污染土壤的短期生态效应评估发现，Cd 对生态指数影响显著，这可能与土壤Cd 的含量相关.但在试验中钝化剂和叶面肥的使用导致线虫NCR 指数降低，有机物分解途径向真菌分解转移，而WI 指数增加，土壤健康状况向好发展[36].氮和磷的有效性限制了生态系统的生产力，土壤养分的有效性和碳氮比是稻田土壤线虫群落的主要调控因子[9,36].这种养分驱动对土壤微生物和线虫的影响可能超过了重金属有效性的负面影响[34,36].

土壤管控模式影响了土壤线虫群落种群动态.例如，农田耕作方式、土壤有机肥使用和杀虫剂喷施等均会对土壤线虫群落多样性和结构产生影响[37-43].在使用土壤钝化剂的农田管理模式下，农田生态系统趋于稳定，且土壤健康状况得到改善，因此钝化剂可用于微量Cd 重金属超标稻田管控[5].土壤线虫群落动态研究对监测农业生态系统、改善农田营养结构、提高人类干预恢复和保护耕地具有重要意义.

3 结论

a) 土壤线虫的丰富度、物种数、生物多样性指数和生态功能指数等在不同时间有显著性差异，说明土壤线虫对环境因素较敏感，适合用于指示土壤理化性质、土壤肥力、土壤食物网结构和功能等变化.

b) 3 种修复措施对水稻土壤线虫丰富度有显著影响，不同试验处理对水稻土壤线虫Shannon-Wiener多样性指数、Simpson 优势度指数、Pielou 均匀度指数的影响与取样时间有交互作用.

c) 3 种修复措施对水稻土壤线虫的生态功能指数—EI 指数、SI 指数、NCR 值和WI 指数均没有显著影响，说明这3 种重金属土壤修复措施对土壤线虫群落的结构和功能没有显著影响.

d) Cd 污染修复措施对水稻土壤线虫生活史策略指数系列(MI 指数、PPI 指数、MI25 指数等)有显著影响.MI 系列指数为线虫群落的加权c-p 值，较好地指示了土壤生态系统的演替和恢复等过程，说明土壤重金属修复模式显著影响了土壤线虫群落的生态系统演替.土壤线虫生活史策略指数可以作为重金属污染土壤修复的成效评价指标.