脂联素对KGN细胞雌激素合成和氧化应激的影响

于婷乔，刘艺芳，袁庆叶，石兴宇，李欣

(1.北京农业职业学院国际教育学院，北京 102442；2.华大智造科技股份有限公司，深圳 518000)

国内外研究显示胰岛素抵抗、肥胖、多囊卵巢综合征(PCOS)等代谢性疾病患者血清脂联素(ADP)水平较低[1]。2004年Sieminska等[2]报道了ADP与PCOS临床表现的相关性，ADP可以改善脱氢表雄酮(DHEA)诱导的小鼠PCOS表型，并上调棕色脂肪组织(BAT)活性[3]。进一步研究发现，ADP可以影响双氢睾酮(DHT)诱导的PCOS小鼠卵巢组织中性激素类固醇合成相关酶Cyp19a1、Hsd3b的mRNA水平[4]。在PCOS大鼠模型中，卵巢组织中ADP受体1和2的表达增加[5-6]，在一定程度上表明，ADP可能通过直接作用于卵巢组织改善PCOS症状。卵巢组织中含有颗粒细胞和膜细胞，PCOS卵巢膜细胞中ADP受体表达下降[7]，在膜细胞中ADP抑制雄烯二酮合成和雄激素合成途径中关键酶表达[8]。胎盘滋养层细胞暴露于ADP同样可以改变其类固醇生成途径[9]。此外，PCOS中ADP水平的降低可能与胰岛素抵抗和氧化应激(OS)的增加有关[2]。ADP通过降低氧化应激或通过脂联素受体1(adipor1)介导的NF-κB通路在a、β暴露的脑内皮细胞(bEnd)中抑制脓毒症内皮细胞凋亡[10]。颗粒细胞在卵子生长和发育过程中发挥重要作用，是卵巢组织合成雌激素的主要位点。但是在卵巢颗粒细胞中，ADP对雌激素合成和氧化应激的影响还尚不清楚。

因此，本研究通过利用人卵巢颗粒细胞系(KGN细胞)外源添加ADP，在毛喉素(forskolin，FSK)处理的前提下，分析细胞中雌二醇、孕酮和芳香化酶(aromatase)的蛋白表达，观察ADP对KGN细胞中雌激素合成的影响；并进一步利用氧化应激诱导剂叔丁基过氧化氢(tBHP)和ADP联合处理，观察ADP对tBHP诱导的细胞氧化应激和凋亡的改善作用。以期探究ADP改善PCOS卵巢功能的分子机制，为PCOS相关疾病的诊疗提供参考。

材料和方法

一、实验材料

1.细胞来源：KGN来源于国家生物医学实验细胞资源库(HTX2045，北京)。

2.主要试剂：DMEM/F12(上海Basalmedia)；胎牛血清(FBS)(Gibco，新西兰)；MTT(88417)、人ADP/Acrp 30/ADIPOQ蛋白(SRP4592)、Forskolin(F3917)(默克，美国)；DCFH-DA(S0033)、丙二醛(MDA)试剂盒及FITC Annexin V凋亡检测试剂盒(碧云天生物)；tBHP溶液(上海麦克林生化)；雄烯二酮(大连美伦生物)；兔源Aromatase(#14528)、鼠源SOD1(#4266)、兔源SOD2(#13141)和鼠源b-actin(#12262)的抗体(Cell Signaling，美国)；超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)检测试剂盒(南京建成生物)。

二、研究方法

1.KGN 细胞培养及分组处理：KGN细胞在添加25 mmol/L葡萄糖、10%FBS、1%青霉素和链霉素的DMEM/F12中生长。当细胞贴壁生长至85%～90%时进行细胞传代，将细胞接种于6孔板。由于KGN细胞无合成雄激素的能力，因此细胞中添加雄烯二酮(100 nmol/L)。

为了分析ADP对KGN细胞活力的影响，ADP的浓度设置了0、0.05、0.125、0.25、0.5、1.0 μg/ml共6个浓度，每组(每个浓度)8个孔，添加ADP后培养24 h，用MTT定量比色法在96孔板上测定细胞活力[9]，选取一个合适浓度(0.05 μg/ml)用于后续实验。

鉴于FSK具有调控类固醇激素合成作用，在分析ADP对KGN细胞雌激素合成的影响时，将细胞分为4组，分别为空白对照组、FSK组(3 μmol/L)[11]、ADP组(0.05 μg/ml)、ADP(0.05 μg/ml)+ FSK(3 μmol/L)组，药物处理24 h后收集细胞。用于检测雌激素水平。

此外，将KGN细胞接种于6孔板，当细胞聚集达到70%，用ADP(0.05 μg/ml)单独或混合tBHP(150 μmol/L)处理24 h，并设置空白对照，收集细胞用于检测细胞抗氧化应激、细胞凋亡和芳香化酶蛋白表达。

2.雌二醇和孕酮的测定：收集ADP和(或)FSK处理的各组细胞，1 000g离心3～5 min后，收集细胞上清，按照ELISA试剂盒(武汉赛培)的使用说明检测雌二醇和孕酮的水平。

3.细胞内活性氧(ROS)测定：用DCFH-DA分光光度法测定细胞内ROS水平。按照1∶1 000用无血清培养液稀释DCFH-DA，终浓度为10 μmol/L。去除细胞培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，在37℃下加入1 ml的10 μmol/L荧光染料进行孵育，20 min后去除荧光染料，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。使用荧光显微镜成像(BX43，Olympus，日本)，并利用多功能酶标仪器(Infinite F50，Tecan，奥地利)检测488/525 nm荧光强度。

4.氧化应激指标的检测：收集不同分组处理的KGN细胞2105个，1 000g离心3～5 min，分离细胞上清，按照各个指标检测试剂盒中的操作说明进行检测。

5.细胞凋亡检测：采用FITC Annexin V凋亡检测试剂盒(碧云天生物)。将KGN细胞以约4×105细胞的密度接种在6个培养皿中，每组3个。ADP加或不加tBHP孵育24 h后，收集细胞，用冷PBS冲洗2次，195 μl 1× binding buffer重悬为1×106细胞/ml的细胞悬液，加入5 μl FITC-Annexin V和10 μl PI，轻轻旋转样品，在20～25℃黑暗中孵育15 min，1 h内用FACScan流式细胞仪(Becton-Dickinson，美国)检测分析。

6.蛋白质印迹(Western Blot)：收集细胞，PBS洗涤3次后加入RIPA裂解液处理30 min，4℃，12 000g离心20 min，收集上清，利用BCA检测蛋白浓度后，取20 μg上样，进行SDS凝胶电泳分离并进行PVDF转膜[12]。转膜结束后用5%BSA封闭30 min，然后加入一抗，其中一抗稀释比例为1∶2 000(3% BSA稀释)，4℃孵育，摇床摇动过夜；TBST 漂洗5次，每次5 min，再加入二抗(稀释比例为1∶7 500，5%脱脂奶粉稀释)，二抗常温孵育1 h后，TBST 漂洗。将洗好的膜放置于保鲜膜上，按照ECL发光试剂盒用成像系统显影(Amersham image 600，GE，瑞典)检测。

三、统计学分析

结 果

一、KGN细胞中ADP促进FSK诱导雌二醇的合成

为了检测ADP对KGN细胞活力的影响，使用不同浓度的ADP处理KGN细胞24 h，MTT法检测细胞活力。结果显示，不同ADP浓度对细胞活力的影响不同，与空白对照组(0 μg/ml)相比，0.25 μg/ml ADP抑制了KGN细胞活力，而0.05 μg/ml ADP显著增强了KGN细胞活力(P<0.05)(图1A)。后续实验采用0.05 μg/ml ADP。

ADP对性激素合成影响的实验结果显示，与空白对照组(Con)相比，FSK组的孕酮和雌二醇水平均显著升高(P<0.05)，而ADP组无显著性变化(P>0.05)；与FSK组相比，ADP+ FSK组的孕酮和雌二醇水平也均显著升高(P<0.05)(图1B、C)。

ADP对芳香化酶表达影响的实验结果显示，与空白对照组(Con)相比，FSK组KGN细胞中芳香化酶的蛋白表达水平显著上升(P<0.05)；而与FSK组相比，ADP+FSK组芳香化酶表达水平虽有上升趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)(图1D、E)。

二、ADP抑制tBHP诱导的KGN细胞氧化应激

利用DCFH-DA染色检测ADP对tBHP诱导的ROS积累的影响，结果表明，与空白对照组(Con)相比，tBHP(150 μmol/L)组的ROS水平和MDA水平显著增加、SOD活性显著下降(P<0.05)；与tBHP组相比，ADP+ tBHP组的ROS水平和MDA水平显著下降、SOD活性显著上升(P<0.05)；T-AOC水平在各组之间无显著性变化(P>0.05)(图2)。

A：不同浓度ADP对细胞活力的影响；B：各组细胞的雌二醇水平；C：各组细胞的孕酮水平；D：各组细胞芳香化酶蛋白的Western Blot图谱；E：各组细胞芳香化酶蛋白表达水平。与Con组比较，*P<0.05；与FSK组比较，#P<0.05。图1 ADP对 KGN细胞活力及雌激素合成的影响

A：各组细胞的DCFH-DA染色荧光显微镜成像；B～E：各组细胞的氧化应激指标水平。与Con组比较，*P<0.05；与tBHP组比较，#P<0.05。图2 各组细胞的氧化应激水平比较

三、ADP可抑制tBHP诱导的细胞凋亡

流式细胞仪检测结果显示，与空白对照组(Con)相比，ADP组细胞凋亡水平显著下降，而tBHP组的细胞凋亡水平显著上升(P<0.05)；与 tBHP组相比，ADP+tBHP组的凋亡水平显著下降(P<0.05)，接近于空白对照水平(P>0.05)(图3)。

四、ADP能上调SOD1蛋白的表达

为研究ADP对于抗氧化蛋白表达水平的影响，我们检测了KGN细胞中两种SOD亚型的表达：铜锌超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD即SOD1)和锰超氧化物歧化酶(MnSOD或SOD2)。实验结果表明，与空白对照(Con)组相比，ADP组的SOD1蛋白水平显著升高(P<0.05)，而SOD2的蛋白水平无显著性变化(P>0.05)(图4)。

A：各组细胞的流式细胞检测图；B：各组的细胞凋亡水平。与Con组比较，*P<0.05；与tBHP组比较，#P<0.05。图3 各组细胞的细胞凋亡水平比较

A：两组细胞表达SOD蛋白的Western Blot图；B：两组细胞的SOD1蛋白和SOD2蛋白表达水平。与Con组比较，*P<0.05。图4 ADP组与空白对照组的SOD蛋白表达水平比较

讨 论

临床上PCOS与低ADP水平和高氧化应激水平相关。然而，PCOS中ADP与氧化应激的关系尚不清楚。本研究发现，ADP可通过增强SOD1表达和SOD活性，抑制氧化应激诱导的KGN细胞凋亡。此外，我们发现ADP可能通过芳香化酶相关途径影响雌二醇和孕酮的合成。

ROS的过量产生会激活氧化应激，进而损害细胞活力，最终导致细胞死亡。双酚A[13]、镉[14]、小檗碱[15]等均可以通过ROS积累而诱导KGN细胞凋亡。在小鼠骨样细胞(MLO-Y4)中，ADP可以降低ROS水平，并抑制骨细胞凋亡[16]。与以往研究结果相一致，本研究发现与空白对照组相比，tBHP处理可以导致KGN细胞中MDA水平增加和SOD活性下降，导致KGN细胞的凋亡；与tBHP处理组相比，联合ADP处理后可以显著下调MDA水平，并上调SOD活性。单独ADP处理即可降低KGN细胞凋亡水平，在一定程度上表明ADP可能作为抗ROS因子或ROS清除剂以缓解氧化应激，从而在氧化应激诱导的细胞凋亡中起保护剂的作用。

SOD能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，是抗氧化酶防御ROS的第一道和最重要的防线[9]。我们前面的研究结果表明，添加ADP可抑制tBHP诱导的氧化应激，并上调细胞中总SOD活性。为了进一步探讨ADP调控氧化应激的分子机制，我们检测了KGN细胞中两种SOD亚型(SOD1和SOD2)的表达，发现ADP上调SOD1蛋白表达水平，但对SOD2表达无显著影响。结果提示ADP的抗氧化能力可能是通过上调SOD1的表达来实现的。此外，在不同细胞类型，包括神经母细胞瘤细胞[17]中同样发现，多种物质可以通过靶向SOD1发挥抗氧化作用而参与细胞凋亡[18-19]。

ADP是脂肪组织分泌的一种脂肪因子，与健康个体的肥胖程度呈负相关[20-21]。ADP水平降低最明显的后果可能是胰岛素敏感性降低[22-23]。本研究显示，低浓度ADP(0.05 μg/ml)可增强FSK促KGN细胞生成孕酮和雌二醇的作用；同时检测到ADP处理后芳香化酶蛋白水平升高。在人颗粒细胞中，在FSH或IGF-1浓度为5 μg/ml时，ADP可增强孕酮和雌二醇的分泌[24-25]。此外，小鼠ADP基因的缺失会干扰激素发生、卵泡发育并降低生育力[26]。因此，了解ADP通过芳香化酶影响性激素的合成有利于探索ADP对卵巢功能影响，进而有助于研究PCOS的发病机制。

PCOS患者ADP水平较低可能与氧化应激产物MDA水平及GSH-PX活性有关。PCOS患者的氧化和抗氧化平衡被破坏。ROS和氧化应激提高了诱导PCOS的发生和细胞周期阻滞几率，导致卵母细胞凋亡[27]。我们的研究结果表明，ADP可以通过上调KGN细胞中SOD1的表达作为活性氧清除剂；ADP可降低氧化应激水平，挽救tBHP诱导的细胞凋亡。ROS的过量产生会激活氧化应激，进而破坏胰岛素信号传导，触发丝氨酸/苏氨酸激酶的激活，最终导致细胞死亡[28]。此外，ADP通过抑制氧化应激激活的内质网应激途径降低内质网应激[27]，从而降低脓毒症引起的细胞凋亡。有研究显示ADP诱导A549人肺泡上皮细胞脂质过氧化增加，并以时间和剂量依赖的方式降低细胞活力[29]，本研究研究结果相反，这种差异可能是由于细胞系的不同以及药物剂量和实验方法的不同。在本研究中，低浓度ADP足以抑制tBHP诱导的氧化应激和KGN细胞凋亡。

高雄激素血症是PCOS的临床特征之一。有研究报道，在H2O2处理的大鼠肝细胞(BRL-3A)中，脱氢表雄酮(DHEA)可提高抗氧化酶活性，减少ROS生成[29]。在人卵巢颗粒细胞(HO-23)中，脱氢表雄酮可以恢复饥饿诱导的ROS生成。因此，PCOS患者，氧化应激的过度产生可能是由于人卵泡液中SOD活性的降低[30]。细胞中抗氧化酶SOD能保护细胞免受自由基的破坏，SOD催化O2-分解生成H2O2和O2，其速率是生理pH条件下自发分解的104倍。我们的结果提示，ADP的抗氧化能力是通过靶向调控SOD来实现的。

综上所述，本研究利用KGN为细胞模型，分析ADP对KGN细胞中雌激素合成、氧化应激水平和细胞凋亡的影响。研究结果表明，ADP可以增强芳香化酶的表达，促进KGN细胞中雌激素合成；此外，ADP通过提高SOD1的表达和SOD的活性，抑制tBHP诱导的KGN细胞的氧化应激和细胞凋亡。本研究为探索ADP改善卵巢功能，缓解PCOS的内在机制提供了一定参考。